一种类风湿性冠心病动物模型及其构建方法和应用与流程

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1.本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种类风湿性冠心病动物模型及其构建方法和应用。

背景技术：

2.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)是一种全身性自身免疫性慢性炎症反应性疾病，其关节内表现为慢性滑膜炎症，关节畸形和功能丧失，关节外表现为累及大、中、小血管的炎症，对心血管具有巨大损伤。ra的发展过程中多种因素可能导致动脉内膜损伤，累计到动脉弹性功能减退，使患者易于并发动脉粥样硬化，造成心肌梗死和卒中的风险显著增加。大量研究显示，类风湿性关节炎与动脉粥样斑块的二者炎症过程非常接近，具有共同的炎症因子作用如il-17、il-6、il-1及tnf-α，这可能是诱发心血管相关疾病的重要炎症环节。
3.类风湿性关节炎患者合并冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,chd)的发病率及病死率明显高于普通人，且病程发展具有隐匿性。国外的调查研究显示，在2004至2014年间类风湿性关节炎患者的chd发病率由0.8％上升到1.4％，且类风湿性关节炎合并冠心病的患者心血管不良事件发生率比普通冠心病患者高出2.6％。我国一项调查研究显示，在风湿性心脏病患者中，合并冠心病为所有共病中发病率最高，提示类风湿性关节炎患者较普通人更易患冠心病。
4.但是当前缺少能够有效在体内或体外模拟类风湿性关节炎合并冠心病的病理过程模型，研究类风湿性冠心病的发病机制与筛选安全有效的药物是一个关键科学问题。因此，构建符合临床病理特征的类风湿性冠心病模型有一定的必要性。

技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种成功率高，有效可靠，可重复性强的类风湿性冠心病动物模型及其构建方法和应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明公开了一种类风湿性冠心病的动物模型的构建方法，包括以下步骤：
8.(1)对实验动物施用牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂，其中，牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂的制备过程如下：牛ⅱ型胶原蛋白冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机与完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂；牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂的制备过程如下：将牛ⅱ型胶原蛋白冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机与不完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂；
9.(2)对步骤(1)的实验动物施以高脂饮食；
10.(3)分开步骤(2)的实验动物的第三和第四根肋骨并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，到左心耳，在左心耳下方2～4毫米处使用线结扎左前降支冠状动脉，观测实验动
物心电图机波形变化；
11.(4)30分钟后松开左前降支冠状动脉结扎，复通左前降支冠状动脉，对步骤(3)的实验动物进行冠状动脉血流再灌注2小时，得所述类风湿性冠心病动物模型。
12.进一步地，步骤(1)中，对实验动物施用牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂的具体过程如下：取制备好的牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂于实验动物左部足趾部及背部4点皮内注射进行初始免疫；一周后，取制备好的牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂于实验动物左部足趾部皮内注射及背部4点皮内注射进行加强免疫，其中，背部4点指的是左右肩胛骨处、背中部及背部距尾根部1cm处。
13.进一步地，步骤(1)中，牛ⅱ型胶原蛋白溶液中牛ⅱ型胶原蛋白的浓度为2mg/ml；高速匀浆机的转速为30000r/min，牛ⅱ型胶原蛋白溶液与完全弗氏佐剂的体积比为1:1；牛ⅱ型胶原蛋白溶液与不完全弗氏佐剂的体积比为1:1。
14.进一步地，步骤(1)中，所述牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂在动物左部足趾部的注射量为0.1ml/只，在背部4点中每点注射量0.02ml/只；所述牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂在实验动物左部足趾部的注射量为0.1ml/只，在背部4点中每点注射量0.02ml/只。
15.进一步地，步骤(2)中，对步骤(1)的实验动物施以高脂饮食的具体过程如下：从第0天到第21天，每日喂养的动脉粥样硬化高脂饲料。
16.进一步地，步骤(2)中动脉粥样硬化高脂饲料的配方中各成分质量百分数含量如下：酪蛋白22.2222％、l-胱氨酸0.3333％、玉米淀粉23.5556％、麦芽糊精107.8889％、蔗糖12.5556％、纤维素bw200 5.5556％、豆油2.7778％、可可脂17.2222％、复合矿物质1.1111％、磷酸氢钙1.4444％、碳酸钙0.6111％、柠檬酸钾1.8333％、复合维生素v10001 1.1111％、重酒石酸氢胆碱0.2222％、胆固醇1.2500％、胆酸钠0.5％；其中，酪蛋白为80目。
17.进一步地，所述实验动物为大鼠。
18.本发明还公开了一种类风湿性冠心病动物模型的构建方法构建的类风湿性冠心病的动物模型。
19.本发明还公开了一种类风湿性冠心病的动物模型在类风湿性关节炎合并冠心病研究中的应用。
20.本发明的有益效果在于：
21.(1)本发明的造模方法简单，模型重各相关指标稳定性好，符合类风湿性冠心病临床病理特征，为类风湿性冠心病动物模型的构建，提供了一种可靠的方法。
22.(2)基于本发明构建的类风湿性冠心病模型，可用于模拟临床类风湿性关节炎合并心脏病的疾病特征和病理过程，探讨风湿性冠心病的发病机制和分子靶标，以及筛选风湿性冠心病的药物。
23.本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发
明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为各组大鼠血清中低密度脂蛋白(ldl-c)含量对比图，数据表示为均数
±
标准差，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01(与正常组相比)；
26.图2为各组大鼠血清中乳酸脱氢酶(ldh)含量对比图，数据表示为均数
±
标准差，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01(与正常组相比)；
27.图3为各组大鼠心肌梗死面积比较图，数据表示为均数
±
标准差，
**
p＜0.01(与正常组相比)；
28.图4为各组大鼠心脏he染结果对比图，放大倍数为100倍，其中，a.正常组；b.心肌缺血再灌注组；c.高脂饮食组；d.胶原性关节炎组；e.胶原性关节炎+心肌缺血再灌注组；f.胶原性关节炎+高脂饮食组；g.心肌缺血再灌注+高脂饮食组；h.胶原性关节炎+高脂饮食+心肌缺血再灌注组；
29.图5为各组大鼠心脏masson染结果对比图，放大倍数为100倍，其中，a.正常组；b.心肌缺血再灌注组；c.高脂饮食组；d.胶原性关节炎组；e.胶原性关节炎+心肌缺血再灌注组；f.胶原性关节炎+高脂饮食组；g.心肌缺血再灌注+高脂饮食组；h.胶原性关节炎+高脂饮食+心肌缺血再灌注组。
具体实施方式
30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1：类风湿性冠心病的动物模型的构建
32.1.实施动物：
33.spf级健康sd大鼠购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。本研究获皖南医学院伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。实验动物饲养于spf级环境内，温度22～25℃，湿度50％，12h昼夜交替。
34.2.实施方法：
35.将64只sd大鼠随机分为如下8组，每组8只：
36.(1)正常组：每组8只，适应性喂养一周后，第0天到第21天，每日喂养足量大鼠普通洁净级饲料。第0天和第7天作为不进行大鼠胶原性关节炎造模的组别在大鼠左足趾部及背部相同点皮内注射等量的生理盐水。第22天腹腔注射2％(30mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠四肢固定好，切开正中气管插入气管导管，连接小动物呼吸机机械通气。胸骨左缘3、4肋开胸，但不进行穿线结扎。观察心电图以及st段，2.5h后自腹腔动脉获得血液、并剪取心脏、肝脏，同时截取大鼠右后肢置于4％多聚甲醛中用于后续实验。
37.(2)心肌缺血再灌注组：每组8只，大鼠适应性喂养一周后，每日喂养大鼠普通洁净级饲料。第0天和第7天作为不进行大鼠胶原性关节炎造模的组别在大鼠左足趾部及背部相同点皮内注射等量的生理盐水。心肌缺血再灌注模型造模方法，第22天腹腔注射2％(30mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠四肢固定好，切开正中气管插入气管导管，连接小动物呼吸
机机械通气。分开实验动物的第三和第四根肋骨，并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，到左心耳，在左心耳下方2～4毫米处使用线结扎左前降支冠状动脉；结扎30min后恢复左前降支灌流，观察结扎前、结扎30min以及恢复循环后心电图以st段显著抬高为心肌缺血标志，st段慢慢回落为再灌注标志，冠状动脉血流再灌注2h后自腹腔动脉获得血液、并剪取心脏、肝脏，同时截取大鼠右后肢置于4％多聚甲醛中用于后续实验。模型制造失败大鼠予以剔除，另选择同一批大鼠进行补充。
38.(3)高脂饮食组：每组8只。所购大鼠适应性喂养一周后，从第0天到第21天，每日喂养足量的动脉粥样硬化高脂饲料。第0天和第7天作为不进行大鼠胶原性关节炎造模的组别在大鼠左足趾部及背部相同点皮内注射等量的生理盐水。第22天腹腔注射2％(30mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠四肢固定好，切开正中气管插入气管导管，连接小动物呼吸机机械通气。分开实验动物的第三和第四根肋骨，并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，但不进行穿线结扎。观察心电图以及st段，2.5h后自腹腔动脉获得血液、并剪取心脏、肝脏，同时截取大鼠右后肢置于4％多聚甲醛中用于后续实验。模型制造失败大鼠予以剔除，另选择同一批大鼠进行补充。
39.(4)胶原性关节炎组：每组8只。所购大鼠适应性喂养一周后，从第0天到第21天，每日喂养足量的大鼠普通洁净级饲料。胶原性关节炎组造模方法：牛ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml)冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机(30000r/min)以1:1的比例与完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂；将牛ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml)冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机(30000r/min)以1：1的比例与不完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂。第0天取制备好的牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂于动物左部足趾部(注射量0.1ml)及背部4点(左右肩胛骨处、背中部及背部距尾根部1cm处)皮内注射(每点注射量0.02ml)进行初始免疫。第7天，取制备好的牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂于大鼠足趾部及背部多点等量皮内注射(足趾部皮内注射量0.1ml，背部各点皮内注射量0.02ml)进行加强免疫，第21天进行胶原性关节炎模型评判。保证注射免疫后大鼠关节炎指数评分≥4分，则为造模成功。第22天腹腔注射2％(30mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠四肢固定好，切开正中气管插入气管导管，连接小动物呼吸机机械通气。分开实验动物的第三和第四根肋骨，并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，但不进行穿线结扎。观察心电图以及st段，2.5h后自腹腔动脉获得血液、并剪取心脏、肝脏，同时截取大鼠右后肢置于4％多聚甲醛中用于后续实验。模型制造失败大鼠予以剔除，另选择同一批大鼠进行补充。
40.(5)胶原性关节炎+心肌缺血再灌注组：每组8只。所购大鼠适应性喂养一周后，因此模型为复合模型，故从第0天到第21天，每日喂养足量的大鼠普通洁净级饲料。胶原性关节炎组造模方法：牛ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml)冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机(30000r/min)以1:1的比例与完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂；将牛ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml)冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机(30000r/min)以1：1的比例与不完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂。第0天取制备好的牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂于动物左部足趾部(注射量0.1ml)及背部4点(左右肩胛骨处、背中部及背部距尾根部1cm处)皮内注射(每点注射量0.02ml)进行初始免疫。第7天，取制备好的牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂于大鼠
足趾部及背部多点等量皮内注射(足趾部皮内注射量0.1ml，背部各点皮内注射量0.02ml)进行加强免疫，第21天进行胶原性关节炎模型评判。保证注射免疫后大鼠关节炎指数评分≥4分，则为造模成功。心肌缺血再灌注模型造模方法，第22天腹腔注射2％(30mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠四肢固定好，切开正中气管插入气管导管，连接小动物呼吸机机械通气。分开实验动物的第三和第四根肋骨，并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，到左心耳，在左心耳下方2～4毫米处使用线结扎左前降支冠状动脉；结扎30min后恢复左前降支灌流，观察结扎前、结扎30min以及恢复循环后心电图以st段显著抬高为心肌缺血标志，st段慢慢回落为再灌注标志，冠状动脉血流再灌注2h后腹腔动脉获得血液、剪取心脏、肝脏同时截取未皮内注射完全弗氏佐剂的大鼠后肢(右后肢)置于4％多聚甲醛中用于后续实验。模型制造失败大鼠予以剔除，另选择同一批大鼠进行补充。
41.(6)胶原性关节炎+高脂饮食组：每组8只。所购大鼠适应性喂养一周后，因此模型为复合模型，故从第0天到第21天，每日喂养足量的动脉粥样硬化高脂饲料。胶原性关节炎组造模方法：牛ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml)冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机(30000r/min)以1:1的比例与完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂；将牛ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml)冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机(30000r/min)以1：1的比例与不完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂。第0天取制备好的牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂于动物左部足趾部(注射量0.1ml)及背部4点(左右肩胛骨处、背中部及背部距尾根部1cm处)皮内注射(每点注射量0.02ml)进行初始免疫。第7天，取制备好的牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂于大鼠足趾部及背部多点等量皮内注射(足趾部皮内注射量0.1ml，背部各点皮内注射量0.02ml)进行加强免疫，第21天进行胶原性关节炎模型评判。保证注射免疫后大鼠关节炎指数评分≥4分，则为造模成功。第22天腹腔注射2％(30mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠四肢固定好，切开正中气管插入气管导管，连接小动物呼吸机机械通气。分开实验动物的第三和第四根肋骨，并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，但不进行穿线结扎。观察心电图以及st段，2.5h后自腹腔动脉获得血液、并剪取心脏、肝脏，同时截取大鼠右后肢置于4％多聚甲醛中用于后续实验。模型制造失败大鼠予以剔除，另选择同一批大鼠进行补充。
42.(7)心肌缺血再灌注+高脂饮食组：每组8只。所购大鼠适应性喂养一周后，因此模型为复合模型，故从第0天到第21天，每日喂养足量的动脉粥样硬化高脂饲料。第0天和第7天作为不进行大鼠胶原性关节炎造模的组别在大鼠左足趾部及背部相同点皮内注射等量的生理盐水。心肌缺血再灌注模型造模方法，第22天腹腔注射2％(30mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠四肢固定好，切开正中气管插入气管导管，连接小动物呼吸机机械通气。分开实验动物的第三和第四根肋骨，并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，到左心耳，在左心耳下方2～4毫米处使用线结扎左前降支冠状动脉；结扎30min后恢复左前降支灌流，观察结扎前、结扎30min以及恢复循环后心电图以st段显著抬高为心肌缺血标志，st段慢慢回落为再灌注标志，冠状动脉血流再灌注2h后腹腔动脉获得血液、剪取心脏、肝脏，同时截取未皮内注射完全弗氏佐剂的大鼠友后肢置于4％多聚甲醛中用于后续实验。模型制造失败大鼠予以剔除，另选择同一批大鼠进行补充。模型制造失败大鼠予以剔除，另选择同一批大鼠进行补充。
43.(8)胶原性关节炎+高脂饮食+心肌缺血再灌注组：每组8只。所购大鼠适应性喂养
一周后，因此模型为复合模型，故从第0天到第21天，每日喂养足量的动脉粥样硬化高脂饲料，胶原性关节炎组造模方法：牛ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml)冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机(30000r/min)以1:1的比例与完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂；将牛ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml)冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机(30000r/min)以1：1的比例与不完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂。第0天取制备好的牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂于动物左部足趾部(注射量0.1ml)及背部4点(左右肩胛骨处、背中部及背部距尾根部1cm处)皮内注射(每点注射量0.02ml)进行初始免疫。第7天，取制备好的牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂于大鼠足趾部及背部多点等量皮内注射(足趾部皮内注射量0.1ml，背部各点皮内注射量0.02ml)进行加强免疫，第21天进行胶原性关节炎模型评判。保证注射免疫后大鼠关节炎指数评分≥4分，则为造模成功。心肌缺血再灌注模型造模方法，第22天腹腔注射2％(30mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠四肢固定好，切开正中气管插入气管导管，连接小动物呼吸机机械通气。分开实验动物的第三和第四根肋骨，并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，到左心耳，在左心耳下方2～4毫米处使用线结扎左前降支冠状动脉；结扎30min后恢复左前降支灌流，观察结扎前、结扎30min以及恢复循环后心电图以st段显著抬高为心肌缺血标志，st段慢慢回落为再灌注标志，冠状动脉血流再灌注2h后腹腔动脉获得血液、剪取心脏、肝脏，同时截取未皮内注射完全弗氏佐剂的大鼠友后肢置于4％多聚甲醛中用于后续实验。模型制造失败大鼠予以剔除，另选择同一批大鼠进行补充。
44.其中，上述提到的动脉粥样硬化高脂饲料的配方中各成分质量百分数含量如下：酪蛋白22.2222％、l-胱氨酸0.3333％、玉米淀粉23.5556％、麦芽糊精107.8889％、蔗糖12.5556％、纤维素bw200 5.5556％、豆油2.7778％、可可脂17.2222％、复合矿物质1.1111％、磷酸氢钙1.4444％、碳酸钙0.6111％、柠檬酸钾1.8333％、复合维生素v10001 1.1111％、重酒石酸氢胆碱0.2222％、胆固醇1.2500％、胆酸钠0.5％；其中，酪蛋白为80目。
45.3.监测指标与方法：
46.3.1大鼠血清中ldl-c水平的检测：
47.采用酶标分析仪检测大鼠血清中hdl-c含量，检测用酶比法，依照试剂盒说明书进行测定。
48.3.2大鼠血清中ldh水平的检测：
49.采用酶标分析仪检测大鼠血清中ldh含量，检测用酶比法，依照试剂盒说明书进行测定。
50.3.3计算各组大鼠心肌梗死面积：
51.再灌注结束后，取各组大鼠心脏，用生理盐水洗去血污，将心脏组织切成0.1～0.2厘米心肌片，将心肌横断面使用氯化硝基四氮唑蓝(nbt)染，37℃孵育15min，用图像分析软件计算心肌横断面梗死面积及整个左心室心肌横断面面积，心肌梗死面积用横断面梗死部分占左心室梗死面积的百分比表示。
52.3.4心肌组织病理学观察：
53.将心肌组织用4％多聚甲醛固定12h,冲洗干净，脱水、透明、包埋，切片，按he及masson染流程染。切片置于光学显微镜下观察各组心肌组织病理学变化。
54.4.实验结果：
55.4.1高脂饮食、牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂注射及结扎冠状动脉左前降支联合处理对aa大鼠继发侧关节肿胀度的影响：
56.牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂注射大鼠于注射后d1～d3表现为急性局部炎症；后逐渐减轻，即急性炎症缓解期(d7～d12)；继而出现迟发型超敏反应，表现为对侧和前肢足爪肿胀，耳、尾出现炎性结节和红斑并伴有体重下降。本实验各免疫大鼠注射胶原完全弗氏佐剂后d14、d17、d21较正常组继发侧关节肿胀度明显增加，表现为继发侧足爪肿胀，说明关节炎造模成功(表1)。
57.表1胶原完全弗氏佐剂大鼠继发侧关节肿胀度的影响
[0058][0059][0060]
*p《0.05,**p《0.01vs.***p《0.001vs.正常组。
[0061]
4.2高脂饮食、胶原完全弗氏佐剂注射及结扎冠状动脉左前降支联合处理对ldl-c水平的影响：
[0062]
高脂、胶原性关节炎及心肌缺血联合处理对大鼠血清ldl-c的影响如图1所示。与正常组相比，高脂饮食组、胶原性关节炎+高脂饮食组、心肌缺血再灌注+高脂饮食组、胶原性关节炎+高脂饮食+心肌缺血再灌注组大鼠血清中ldl-c水平增高。实验结果表明高脂饮食可增加大鼠血清中ldl-c含量，高脂饮食、牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂注射及结扎冠状动脉左前降支联合处理可稳定增加大鼠血清中ldl-c含量。
[0063]
4.3高脂饮食、牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂注射及结扎冠状动脉左前降支联合处理对ldh水平的影响
[0064]
高脂、胶原性关节炎及心肌缺血联合处理对大鼠血清ldh的影响如图2所示。与正常组相比，心肌缺血再灌注组、胶原性关节炎+心肌缺血再灌注组、心肌缺血再灌注+高脂饮食组、胶原性关节炎+高脂饮食+心肌缺血再灌注组大鼠血清中ldh水平增高。实验结果表明结扎冠状动脉左前降支可使大鼠血清中ldh含量增加，高脂饮食、牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂注射及结扎冠状动脉左前降支联合处理可稳定增
加大鼠血清中ldh含量。
[0065]
4.4各组大鼠心肌梗死面积比较：
[0066]
正常组大鼠心脏结构完整，无缺血性损伤。与正常组相比，心肌缺血再灌注组、胶原性关节炎+心肌缺血再灌注组、心肌缺血再灌注+高脂饮食组、胶原性关节炎+高脂饮食+心肌缺血再灌注组大鼠心脏心肌梗死面积均增加，见图3。
[0067]
4.5高脂饮食、牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂注射及结扎冠状动脉左前降支联合处理对心脏病理病变程度的影响：
[0068]
由he染结果可知，正常组心脏组织结构紧凑清晰，无明显病理改变；高脂饮食组与胶原性关节炎模型组心脏组织有轻微炎症细胞浸润；胶原性关节炎+心肌缺血再灌注组、高脂饮食+心肌缺血再灌注组与高脂饮食+心肌缺血再灌注+胶原性关节炎组心肌细胞明显肥大，肌束间可见较多成纤维细胞，心肌纤维层排列不整齐，有断裂层，其中以高脂饮食+心肌缺血再灌注+胶原性关节炎组病理改变最为明显，见图4。masson染结果显示正常组大鼠心肌细胞呈现红，未见蓝，无明显的胶原沉积；高脂饮食组与胶原性关节炎模型组心脏组织有轻微炎性浸润；胶原性关节炎+心肌缺血再灌注组、高脂饮食+心肌缺血再灌注组与高脂饮食+心肌缺血再灌注+胶原性关节炎组大鼠心脏有较多的成纤维细胞出现，纤维结缔组织增生，心肌间质可见大片蓝，大量心肌胶原沉积于心肌间质，以高脂饮食+心肌缺血再灌注+胶原性关节炎组病理改变最为明显，见图5。
[0069]
本发明方法通过给予雄鼠注射牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂同时给予高脂饮食足量喂养3周后结扎冠状动脉左前降支联合处理，胶原性关节炎+高脂饮食+心肌缺血再灌注组出现血清中ldl-c及ldh水平增加、心脏梗死面积增加及不同程度病理改变等类风湿性冠心病类似的典型特征，说明成功建立了与风湿性冠心病临床特点相符的模型。本发明的造模方法简单，模型中ldl-c水平、ldh水平和心脏病理等指标稳定性好，说明本发明造模方法稳定有效可靠，可重复性强。
[0070]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：

1.一种类风湿性冠心病的动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对实验动物施用牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂，其中，牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂的制备过程如下：牛ⅱ型胶原蛋白冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机与完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂；牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂的制备过程如下：将牛ⅱ型胶原蛋白冰浴后溶解在冰醋酸中得到牛ⅱ型胶原蛋白溶液，并用高速匀浆机与不完全弗氏佐剂乳化，制备成牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂；(2)对步骤(1)的实验动物施以高脂饮食；(3)分开步骤(2)的实验动物的第三和第四根肋骨并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，到左心耳，在左心耳下方2～4毫米处使用线结扎左前降支冠状动脉，观测实验动物心电图机波形变化；(4)30分钟后松开左前降支冠状动脉结扎，复通左前降支冠状动脉，对步骤(3)的实验动物进行冠状动脉血流再灌注2小时，得所述类风湿性冠心病动物模型。2.根据权利要求1所述的一种类风湿性冠心病的动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，对实验动物施用牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂的具体过程如下：取制备好的牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂于实验动物左部足趾部及背部4点皮内注射进行初始免疫；一周后，取制备好的牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂于实验动物左部足趾部皮内注射及背部4点皮内注射进行加强免疫，其中，背部4点指的是左右肩胛骨处、背中部及背部距尾根部1cm处。3.根据权利要求1所述的一种类风湿性冠心病的动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，牛ⅱ型胶原蛋白溶液中牛ⅱ型胶原蛋白的浓度为2mg/ml；高速匀浆机的转速为30000r/min，牛ⅱ型胶原蛋白溶液与完全弗氏佐剂的体积比为1:1；牛ⅱ型胶原蛋白溶液与不完全弗氏佐剂的体积比为1:1。4.根据权利要求2所述的一种类风湿性冠心病的动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述牛ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂在动物左部足趾部的注射量为0.1ml/只，在背部4点中每点注射量0.02ml/只；所述牛ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂在实验动物左部足趾部的注射量为0.1ml/只，在背部4点中每点注射量0.02ml/只。5.根据权利要求1所述的一种类风湿性冠心病的动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，对步骤(1)的实验动物施以高脂饮食的具体过程如下：从第0天到第21天，每日喂养的动脉粥样硬化高脂饲料。6.根据权利要求5所述的一种类风湿性冠心病的动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中动脉粥样硬化高脂饲料的配方中各成分质量百分数含量如下：酪蛋白22.2222％、l-胱氨酸0.3333％、玉米淀粉23.5556％、麦芽糊精107.8889％、蔗糖12.5556％、纤维素bw200 5.5556％、豆油2.7778％、可可脂17.2222％、复合矿物质1.1111％、磷酸氢钙1.4444％、碳酸钙0.6111％、柠檬酸钾1.8333％、复合维生素v10001 1.1111％、重酒石酸氢胆碱0.2222％、胆固醇1.2500％、胆酸钠0.5％；其中，酪蛋白为80目。7.根据权利要求1所述的一种类风湿性冠心病的动物模型的构建方法，其特征在于，所述实验动物为大鼠。8.一种采用如权利要求1～7任一项所述的类风湿性冠心病动物模型的构建方法构建
的类风湿性冠心病的动物模型。9.一种如权利要求8所述的类风湿性冠心病的动物模型在类风湿性关节炎合并冠心病研究中的应用。

技术总结

本发明公开了一种类风湿性冠心病的动物模型及其构建方法和应用，构建方法包括以下步骤：(1)对实验动物施用牛Ⅱ型胶原完全弗氏佐剂乳剂和牛Ⅱ型胶原不完全弗氏佐剂乳剂；(2)对步骤(1)的实验动物施以高脂饮食；(3)分开步骤(2)的实验动物的第三和第四根肋骨并剪断实验动物的第三和第四根肋骨，到左心耳，在左心耳下方2～4毫米处使用线结扎左前降支冠状动脉，观测实验动物心电图机波形变化；(4)30分钟后松开左前降支冠状动脉结扎，复通左前降支冠状动脉，进行冠状动脉血流再灌注2小时，得所述类风湿性冠心病动物模型。本发明的造模方法简单，模型重各相关指标稳定性好。模型重各相关指标稳定性好。模型重各相关指标稳定性好。