间充质干细胞的制备方法

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1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及间充质干细胞的制备方法。

背景技术：

2.2016年国家提出发展先进高效生物技术，开展重大疫苗、抗体研制、免疫、基因、细胞、干细胞与再生医学、人体微生物组解析及调控等关键技术研究的指导方向。
3.间充质干细胞是一种重要的干细胞，具有多向分化能力，可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等细胞，是细胞的重要种子细胞之一。2006 年，国际细胞协会(international society forcell&gene therapy,isct) 规范了间充质干细胞的定义，至少需符合以下三个标准：1.呈梭形、贴壁生长； 2.细胞表面表达特定的特异性抗原(标记物)：cd105、cd73和cd90(阳性表达)；cd45、cd34、cd14、cd79和hla-dr(阴性表达)；3.具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的能力。
4.临床研究和使用的种类包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胰岛β细胞、成纤维细胞等。现有研究已从牙髓、牙周、根尖周等组织中提取出间充质干细胞，但上述来源的间充质干细胞，存在来源有限、提取受限、难以大量培养扩增的难点。
5.现有研究多采用酶消化法培养口腔黏膜间充质干细胞，提高了技术难度，增加了操作步骤和技术成本。酶消化过程，可能影响间充质干细胞的活性。
6.因此，寻一种技术难度低、操作步骤简单的培养口腔黏膜间充质干细胞的方法至关重要。

技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了间充质干细胞的制备方法。本发明采用的制备方法明确了舌黏膜、颊黏膜、牙龈、上腭黏膜在内的口腔黏膜组织中均可提取到间充质干细胞，同时通过分离获得口腔黏膜下层，减少上皮层中上皮细胞干扰，更易通过后续的组织贴壁法培养获得间充质干细胞。而且，本发明采用的制备方法无需使用酶进行消化，仅采用简单易操作的组织块贴壁法，简化了操作步骤。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了间充质干细胞的制备方法，取口腔黏膜组织培养，清洗后，经组织块贴壁培养，获得所述间充质干细胞。
10.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述口腔黏膜组织为口腔下层黏膜组织。
11.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述口腔黏膜组织培养不包括酶消化的步骤。
12.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述口腔黏膜组织包括：舌黏膜、颊黏膜、牙龈或上腭黏膜中的一种或多种。
13.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述口腔黏膜组织培养离体后采用α-mem培养基保存；所述α-mem培养基包括2％的青霉素和链霉素。
14.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述清洗采用pbs缓冲液；所述pbs缓冲液包括2％的青霉素和链霉素。
15.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述组织块贴壁培养包括：取组织块制成混悬液，第一培养，翻转后，第二培养。
16.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述制成混悬液或所述第一培养采用α-mem培养基；所述α-mem培养基包括1％的抗生素和10％的 fbs。
17.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述抗生素包括青霉素和链霉素。
18.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第一培养的时间为 2～3h。
19.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第二培养的时间为 7～14天。
20.本发明提供了间充质干细胞的制备方法，取口腔黏膜组织培养，清洗后，经组织块贴壁培养，获得所述间充质干细胞。
21.本发明的有益效果包括：
22.(1)精确取材方法。本发明明确了分离口腔黏膜下层组织培养间充质干细胞，避免了培养过程中需要用酶消化组织、去除上皮细胞带来的技术困难和潜在污染风险。
23.(2)扩大取材部位。本发明明确了舌黏膜、颊黏膜、上腭黏膜、牙龈等口腔黏膜组织的黏膜下层中，均可提取并培养间充质干细胞，如图1所示。
24.(3)简化原代培养方法。本发明采用组织块贴壁法培养间充质干细胞，降低了技术难度，避免了酶对细胞的损伤，减少了培养成本。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
26.图1示口腔黏膜组织物理处理前后原代培养情况；其中：a示无物理处理，未剪去口腔黏膜上皮层组织，原代培养中混杂上皮细胞(红框中)；b示本发明中采用物理处理的方法，剪去上皮组织，原代培养过程中无明显上皮细胞长入；
27.图2示口腔黏膜下层组织；其中：箭头所示为组织块；
28.图3示培养瓶中的组织块；
29.图4示原代培养口腔黏膜间充质干细胞；
30.图5示流式鉴定口腔黏膜间充质干细胞；其中：从左至右依次为：cd105、 cd90、stro-1、cd73、cd34；
31.图6示间充质干细胞成骨诱导；
32.图7示间充质干细胞成脂诱导。
具体实施方式
33.本发明公开了间充质干细胞的制备方法。
34.应该理解，表述
“……
中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理
解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
35.术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
36.应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
37.本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
38.此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或 0.5％之内。
39.本发明间充质干细胞的制备方法和验证例中，所用原料及试剂均可由市场购得。
40.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
41.实施例1间充质干细胞的制备方法
42.(1)切取达口腔黏膜下层的口腔黏膜组织块0.5
×
0.5
×
0.8cm3，用锐利的剪刀切取黏膜下层，放入含2％青霉素和链霉素、1mlα-mem培养基的2.5 ml ep管中。ep管标注样本来源及取材时间，放4℃冰箱保存(如图2所示)， 48h内转入超净台提取培养间充质干细胞。
43.(2)超净台内操作，吸除浸泡组织块的培养基，用含2％青霉素和链霉素的pbs冲洗3次，末次冲洗可静置5～10min，之后吸净去除pbs。加入100μl 含1％青霉素和链霉素、10％fbs的α-mem培养，用眼科剪剪碎组织块，至组织块为0.5～1.0mm3大小。1ml头或一次性刻度吸管等轻轻吸取含剪碎后组织块的混悬液，转入25cm2培养瓶中，将组织块均匀涂抹在培养瓶瓶底(如图3所示)，培养组织块为剪碎后0.5～1.0mm3大小的口腔黏膜下层组织块，采用组织块培养法，均匀贴附在培养瓶瓶底。可见口腔黏膜组织用量极少。
44.(3)将瓶轻轻正立，加入5～8ml含1％青霉素和人链霉素、10％fbs的α-mem培养，倒转培养瓶使组织块贴壁面朝上，放入培养箱中2～3h。从培养箱中轻轻取出培养瓶，避免震荡导致组织块掉落。轻轻翻转，培养基浸没组织块，保持组织块贴壁。
45.(4)培养7～14d，显微镜下可见间充质干细胞从组织块中爬出(如图4 所示)，可见梭形、贴壁的间充质干细胞。当组织块周围间充质干细胞成团块后，胰酶消化，传代培养。
46.验证例1流式鉴定间充质干细胞表面标志物
47.实验结果如图5所示，cd105、cd90、cd73阳性表达，stro-1、cd34 阴性表达。因此，通过实施例1的制备方法获得的的口腔黏膜下层的间充质干细胞，可以表达特异性的间充质干细胞表面标志物。
48.验证例2间充质干细胞成骨诱导
49.实验结果如图6所示，
×
10倍镜下可见红的钙结节，表明通过实施例 1的制备方法获得的口腔黏膜下层的间充质干细胞，具有成骨分化的能力。验证例3间充质干细胞成脂
诱导
50.实验结果如图7所示，
×
10倍镜下可见红的脂滴，表明通过实施例1 的制备方法获得的的口腔黏膜下层的间充质干细胞，具有成脂分化的能力。
51.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.间充质干细胞的制备方法，其特征在于，取口腔黏膜组织培养，清洗后，经组织块贴壁培养，获得所述间充质干细胞。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述口腔黏膜组织培养不包括酶消化的步骤。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述口腔黏膜组织包括：舌黏膜、颊黏膜、牙龈或上腭黏膜中的一种或多种。4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述口腔黏膜组织培养离体后采用α-mem培养基保存；所述α-mem培养基包括2％的青霉素和链霉素。5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述清洗采用pbs缓冲液；所述pbs缓冲液包括2％的青霉素和链霉素。6.如权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述组织块贴壁培养包括：取组织块制成混悬液，第一培养，翻转后，第二培养。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制成混悬液或所述第一培养采用α-mem培养基；所述α-mem培养基包括1％的抗生素和10％的fbs。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述抗生素包括青霉素和链霉素。9.如权利要求6至8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一培养的时间为2～3h。10.如权利要求6至9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第二培养的时间为7～14天。

技术总结

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及间充质干细胞的制备方法。本发明提供了间充质干细胞的制备方法，取口腔黏膜组织培养，清洗后，经组织块贴壁培养，获得所述间充质干细胞。本发明采用的制备方法明确了舌黏膜、颊黏膜、牙龈、上腭黏膜在内的口腔黏膜组织中均可提取到间充质干细胞，同时通过分离获得口腔黏膜下层，减少上皮层中上皮细胞干扰，更易通过后续的组织贴壁法培养获得间充质干细胞。而且，本发明采用的制备方法无需使用酶进行消化，仅采用简单易操作的组织块贴壁法，简化了操作步骤。简化了操作步骤。