一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法与流程

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1.本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法。

背景技术：

2.腐烂茎线虫(ditylenchus destructor)是危害马铃薯与甘薯等作物的重要植物病原线虫，其寄主范围广泛，还可以危害豌豆、当归、薄荷、三七、花生、啤酒花、烟草、向日葵、西洋参、党参、当归、鸢尾、郁金香等90～120种植物。该线虫最初于1937年由日本传入我国，而我国对于腐烂茎线虫的研究起步较晚，有关我国腐烂茎线虫的报道最早见于1982年。目前，腐烂茎线虫在我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、新疆、北京、河北、河南、山东、安徽、江苏、浙江、福建、湖北、云南、贵州等地普遍发生，且有进一步暴发成灾趋势。当前急需对腐烂茎线虫开展科学防控技术研究。
3.为了深入全面地研究腐烂茎线虫，试验需要大量的虫源。目前已经有相关研究建立了利用马铃薯、甘薯、胡萝卜等作物的活体植物组织培养方法以及利用葡萄孢属(botrytis)、镰孢菌属(fusarium)、链格孢属(alternaria)、丝核菌属(rhizoctonia)、青霉属(penicillium)等约40个属70多种真菌的真菌培养方法。但是由于腐烂茎线虫世代重叠严重，虫态很不整齐，无论是活体植物组织培养还是真菌培养，腐烂茎线虫都是成虫、幼虫和卵三者同时存在，对于后续开展深入研究造成了障碍。
4.现有线虫分离收集方法主要为浅盘法与漏斗法，或者二者的结合，上述分离方式都需要依赖虫体自身的运动能力，而虫卵本身并无运动能力，因此现有腐烂茎线虫分离方法无法有效收集到腐烂茎线虫虫卵。
5.因此，需要研究一种可单独收集腐烂茎线虫虫卵的方法。

技术实现要素：

6.鉴于以上技术问题，本发明首次建立了腐烂茎线虫虫卵的收集方法，可以有效且大量分离收集到腐烂茎线虫虫卵，为后续富集不同虫态虫体及开展各种虫态的特异性研究奠定了基础。
7.本发明提供一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，包括以下步骤：
8.将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液混合，离心，所得上清液与沉淀分别过滤，收集滤液，滤液合并后离心，收集沉淀a；
9.将所述沉淀a用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀，缓慢加入水，离心，收集水与蔗糖溶液分界处的虫液，加水稀释后再次离心，收集沉淀b；
10.将所述沉淀b用质量分数25～45％蔗糖溶液分散成混悬液，加入水，离心，收集沉淀c，加水稀释后再次离心，收集沉淀d，即得腐烂茎线虫虫卵。
11.优选地，所述含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液的用量比为1g∶2～10ml。
12.优选地，所述沉淀a与质量分数70～80％蔗糖溶液的体积比为1∶6～10。
13.优选地，所述沉淀b与质量分数25～35％蔗糖溶液的体积比为1∶2～10。
14.优选地，所述离心是在2000～4000rpm离心5～10min。
15.优选地，所述过滤是过100目筛网，并用水多次冲洗筛网。
16.优选地，所述加水稀释是将虫液或沉淀c与水按体积比1∶5～10混合。
17.对比现有技术，本发明的有益效果为：
18.本发明提供的腐烂茎线虫虫卵的收集方法，采用蔗糖密度梯度离心，能够有效将虫卵与幼虫、成虫区分开来，从混合虫态的腐烂茎线虫体中大量分离纯化得到虫卵。
附图说明
19.图1是实施例1中腐烂茎线虫虫卵收集效果图；
20.图2是实施例2中腐烂茎线虫虫卵收集效果图。
具体实施方式
21.本发明结合实施例和相应附图做进一步阐释说明，以下实施例仅用于说明目的，不用于限制本发明范围。
22.本发明提供的腐烂茎线虫虫卵的收集方法，适用于腐烂茎线虫侵害的马铃薯、甘薯、番茄、辣椒、大豆、胡萝卜、黄瓜、花生、小麦、郁金香及当归、党参等多种植物组织或真菌菌体培养基中腐烂茎线虫的快速分离，由于所用材料的不同并不影响分离效果，故本发明实施例仅以腐烂茎线虫主要危害的甘薯组织及镰刀菌培养基为例对其含有的腐烂茎线虫的分离效果进行说明，对其他含有腐烂茎线虫的材料中腐烂茎线虫的分离不再赘述。
23.实施例1
24.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，包括以下步骤：
25.(1)、用刀将含有腐烂茎线虫的甘薯切成碎渣(类似于做馅)，将碎渣装入玻璃离心管中，向管内加入质量分数35％蔗糖溶液(35％蔗糖溶液与碎渣的用量比为2ml∶1g)，3000rpm离心5min，得到上清液及沉淀，薯块中的腐烂茎线虫即可从薯块中初步分离；
26.(2)、将(1)中上清液与离心所得沉淀分别过100目筛网，并用10倍体积清水冲洗筛网上残留的碎渣，收集滤液，合并，这时上清液及薯渣中附着的腐烂茎线虫即可被全部分离至滤液中，同时薯块中的大块植物组织也被去除，有效避免其对线虫收集过程的干扰；
27.(3)、将合并的滤液装入玻璃离心管中，3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀；在该离心过程中，部分无法用筛网剔除的细小淀粉颗粒与线虫虫体一起分离，进而被沉淀富集；
28.(4)、向玻璃离心管内加入相当于底部沉淀6倍体积的质量分数80％蔗糖溶液，用胶头滴管反复吹打，使沉淀中的淀粉颗粒及虫体充分悬浮，形成溶液状态，避免大量沉淀聚集在底部而无法充分分散；
29.(5)、用胶头滴管向玻璃离心管内缓慢贴壁加入2ml清水，确保新加入的清水与下层质量分数80％蔗糖溶液形成分层而不混合，3000rpm离心5min；用胶头滴管收集清水与蔗糖溶液分界面上的虫液，转入新的玻璃离心管中，并立刻加入10倍体积清水并用胶头滴管反复吹打，充分稀释虫液；
30.室温下水的密度约为1.0g/ml，质量分数80％蔗糖溶液密度介于1.3～1.4g/ml，通过向蔗糖溶液中轻柔的加入清水以及离心，清水与蔗糖溶液可以分成明显的上下两层。这
时淀粉颗粒由于密度较大，因此离心后会分布在蔗糖溶液中，形成大量沉淀聚集在离心管底部；而线虫虫体密度大于水而小于蔗糖溶液，因此离心后会分布在清水与蔗糖溶液的交界面处，从而有效地将虫体与细小淀粉颗粒分离；
31.将虫体用胶头吸管转出后快速且立刻加入大量清水能够对蔗糖溶液进行稀释，避免虫体在高浓度蔗糖溶液中长期浸泡；
32.(6)、用玻璃离心管将稀释后的虫液3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀；
33.(7)、向离心管内加入相当于底部沉淀2倍体积的质量分数30％蔗糖溶液，用胶头滴管反复吹打，使沉淀在溶液内均匀分散成混悬液；
34.步骤(6)中收集到的沉淀为腐烂茎线虫虫卵、幼虫、成虫的混合体，通过向管内加入蔗糖溶液并反复吹打，可以使不同龄期的虫体充分悬浮，形成溶液状态，避免大量沉淀聚集在底部而使后续分离效果不佳；
35.(8)、用胶头滴管向玻璃离心管内贴壁加入2ml清水，确保新加入的清水与下层质量分数35％蔗糖溶液形成分层而不混合，3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀，并立刻加入10倍体积清水并用胶头滴管反复吹打，充分稀释虫液；
36.室温下水的密度约为1.0g/ml，质量分数35％蔗糖溶液的密度约为1.15g/ml，水与35％蔗糖溶液混合可分为两层。腐烂茎线虫的虫卵与线状的幼虫、成虫在密度上有较大区别，虫卵的密度大于35％蔗糖溶液的密度，因此离心后会沉淀至管底，而线状的幼虫与成虫会介于清水与蔗糖溶液的交界面处；
37.(9)、用玻璃离心管将稀释后的虫液3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀，即得到大量腐烂茎线虫虫卵。此步骤可以重复2～3次，对收集到的虫体用清水反复洗涤，充分稀释蔗糖溶液，避免对虫体造成损伤。
38.实施例2
39.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，包括以下步骤：
40.(1)、用手术刀片将带镰刀菌菌体的培养基切割成小块转移至离心管中，向管内加入质量分数35％蔗糖溶液(35％蔗糖溶液与小块培养基的用量比为2ml∶1g)，3000rpm离心5min，得到上清液及沉淀；镰刀菌菌体培养基中的腐烂茎线虫被初步分离；
41.(2)、将(1)中上清液与离心所得沉淀分别过100目筛网，并用10倍体积清水冲洗筛网上残留的碎渣，收集滤液；
42.(3)、将滤液装入玻璃离心管中，3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀；
43.(4)、向玻璃离心管内加入相当于底部沉淀6倍体积的质量分数80％蔗糖溶液，用胶头滴管反复吹打，使沉淀在溶液内均匀分散成混悬液；
44.沉淀中含有镰刀菌菌丝与孢子，后续影响线虫虫体的收集纯度，通过加入蔗糖溶液反复吹打，可使全部沉淀均匀悬浮，避免影响后续分离效率；
45.(5)、用胶头滴管向玻璃离心管内缓慢贴壁加入2ml清水，确保新加入的清水与下层80％蔗糖溶液形成分层而不混合，3000rpm离心5min；
46.(6)、用胶头滴管收集清水与蔗糖溶液分界面上的虫液，转入新的玻璃离心管中，并立刻加入10倍体积清水并用胶头滴管反复吹打，充分稀释虫液；
47.(7)、用玻璃离心管将稀释后的虫液3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀；
48.(8)、向离心管内加入相当于底部沉淀2倍体积的30％蔗糖溶液，用胶头滴管反复
吹打，使沉淀在溶液内均匀分散成混悬液；
49.由于步骤(7)收集到的沉淀为腐烂茎线虫虫卵、幼虫、成虫的混合体，通过向管内加入蔗糖溶液并反复吹打，可以使不同龄期的虫体充分悬浮，形成溶液状态，避免大量沉淀聚集在底部而使后续步骤分离效果不佳；
50.(9)、用胶头滴管向玻璃离心管内贴壁加入2ml清水，确保新加入的清水与下层35％蔗糖溶液形成分层而不混合，3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀，并立刻加入10倍体积清水并用胶头滴管反复吹打，充分稀释虫液；
51.室温下水的密度约为1.0g/ml，质量分数35％蔗糖溶液的密度约为1.15g/ml，水与蔗糖溶液混合可分为两层。腐烂茎线虫的虫卵与线状的幼虫、成虫在密度上有较大区别，虫卵的密度大于35％蔗糖溶液的密度，因此离心后会沉淀至管底，而线状的幼虫与成虫会介于清水与蔗糖溶液的交界面处；
52.(10)、用玻璃离心管将稀释后的虫液3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀，即得到大量腐烂茎线虫虫卵。
53.实施例3
54.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，与实施例1的不同仅在于：步骤(1)中所用蔗糖溶液的质量分数为30％，30％蔗糖溶液与碎渣的用量比为10ml∶1g。
55.实施例4
56.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，与实施例1的不同仅在于：步骤(1)中所用蔗糖溶液的质量分数为40％，40％蔗糖溶液与碎渣的用量比为8ml∶1g。
57.实施例5
58.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，与实施例1的不同仅在于：步骤(4)中所用蔗糖溶液的质量分数为70％，用量为底部沉淀的10倍体积。
59.实施例6
60.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，与实施例1的不同仅在于：步骤(8)中所用蔗糖溶液的质量分数为25％，用量为底部沉淀的6倍体积。
61.实施例7
62.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，与实施例1的不同仅在于：步骤(8)中所用蔗糖溶液的质量分数为45％，用量为底部沉淀的10倍体积。
63.实施例8
64.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，与实施例1的不同仅在于：所有离心是在2000rpm离心10min。
65.实施例9
66.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，与实施例1的不同仅在于：所有离心是在4000rpm离心5min。
67.将实施例1及实施例2收集到的沉淀(由于实施例1与实施例3～9提供的方法所获得的分离效果基本相同，故此处仅以实施例1为例进行说明)加水稀释后置于显微镜下进行观察。
68.如图1-2所示，使用本发明的方法收集到的腐烂茎线虫虫卵的纯度较高，且基本不存在幼虫、成虫等其他发育期的虫体。
69.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

技术特征：

1.一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液混合，离心，所得上清液与沉淀分别过滤，收集滤液，滤液合并后离心，收集沉淀a；将所述沉淀a用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀，缓慢加入水，离心，收集水与蔗糖溶液分界处的虫液，加水稀释后再次离心，收集沉淀b；将所述沉淀b用质量分数25～45％蔗糖溶液分散成混悬液，加入水，离心，收集沉淀c，加水稀释后再次离心，收集沉淀d，即得腐烂茎线虫虫卵。2.根据权利要求1所述的快速分离方法，其特征在于，所述含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液的用量比为1g∶2～10ml。3.根据权利要求2所述的快速分离方法，其特征在于，所述沉淀a与质量分数70～80％蔗糖溶液的体积比为1∶6～10。4.根据权利要求3所述的快速分离方法，其特征在于，所述沉淀b与质量分数25～45％蔗糖溶液的体积比为1∶2～10。5.根据权利要求4所述的收集方法，其特征在于，所述离心是在2000～4000rpm离心5～10min。6.根据权利要求1所述的收集方法，其特征在于，所述过滤是过100目筛网，并用水多次冲洗筛网。7.根据权利要求1所述的收集方法，其特征在于，所述加水稀释是将所述虫液或所述沉淀c与水按体积比1∶5～10混合。

技术总结

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种腐烂茎线虫虫卵的收集方法，包括以下步骤：将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液混合，离心，所得上清液与沉淀分别过滤，收集滤液，滤液合并后离心，收集沉淀A；将沉淀A用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀，缓慢加入水，离心，收集水与蔗糖溶液分界处的虫液，加水稀释后再次离心，收集沉淀B；将沉淀B用质量分数25～45％蔗糖溶液分散，加入水，离心，收集沉淀C，加水稀释后再次离心，收集沉淀D，即得腐烂茎线虫虫卵。本发明提供的收集方法，采用蔗糖密度梯度离心，能够有效将虫卵与幼虫、成虫区分开来，从混合虫态的腐烂茎线虫体中大量分离纯化得到虫卵。大量分离纯化得到虫卵。大量分离纯化得到虫卵。