水质 综合毒性的测定 现场快速监测发光细菌法（试行） 二〇二〇年七月
目次
前言
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水质综合毒性现场快速监测方法，制定本方法。
本方法规定了地表水、地下水、生活污水和工业废水中综合毒性的现场快速监测发光细菌法。
本方法由中国环境监测总站组织制订。
本方法起草单位：中国科学院生态环境研究中心。
本方法验证单位：湖南省生态环境监测中心、云南省环境监测中心站、河南省生态环境监测
中心、河北省生态环境监测中心、湖南力合检测技术服务有限公司、湖南长沙生态环境监测中心。
本方法主要起草人：李红岩、张艳芬、于志勇、马梅、饶凯锋、张琳琳、刘勇、吴洁、丁雄。
本方法由中国环境监测总站解释。
水质 综合毒性的测定 现场快速监测发光细菌法（试行）
1 适用范围
本方法规定了测定水质综合毒性的现场快速监测发光细菌法。
本方法适用于对地表水、地下水、生活污水和工业废水综合毒性的快速测定。
2 规范性引用文件
调节臂本方法引用了下列文件或其中的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
ISO 11348-3 | 水质检测-水样对费氏弧菌发光的抑制效应的测定 |
ISO 5667-16 | |
GB/T 15441 | 水质急性毒性的测定发光细菌法 |
SN/T 5103 | 国境口岸饮用水生物毒性发光细菌检测方法 |
HJ/T 91 | 地表水和污水监测技术规范 |
HJ/T 91.1 | 污水监测技术规范 |
HJ/T 164 | 地下水环境监测技术规范 |
HJ 589 | 突发环境事件应急监测技术规范 |
| |
3 术语和定义
3.1 发光细菌luminescent bacteria
发光细菌是一类非致病的革兰氏兼性厌氧微生物，在适当条件下能发射出肉眼可见的蓝绿
光，且发光强度与其接触的毒物浓度在一定的浓度范围内有对应关系。常用的菌种有明亮发光杆菌、费氏弧菌等。
3.2 相对发光强度 relative luminous intensity
加入样品的受试发光细菌发光强度与对照发光强度的比值，单位为%。
3.3 抑制率 inhibition rate
加入样品的受试发光细菌发光强度相对于对照发光强度的衰减百分比，数值上等于“1-相对发光强度”，单位为%。本方法使用抑制率表征毒性。
4 方法原理
利用发光细菌（明亮发光杆菌、费氏弧菌等）与样品有毒物质接触反应一定的时间后，可影响或干扰细菌的新陈代谢，使细菌的发光强度下降，其对发光强度的抑制程度与所受有毒有害物质的毒性及浓度有对应关系，光强度的变化可以用生物发光检测仪检测。
5 干扰和消除
5.1挥发性物质、与稀释水反应的物质或者测试过程中状态发生改变的物质，可能会影响测试结果或者导致重复性结果差异增大。对于含不可溶解、微溶物质的样品或者悬浮溶液，通过离心或者过滤去除干扰。
5.2由于光吸收或者光散射导致的光损失可能在高度或者混浊溶液中发生，浊度较高的样品应该进行1个小时的沉淀处理。本方法只能测定包括度影响在内的综合毒性。
5.3因为生物发光需要溶解氧浓度大于0.5mg/L，高需氧量或低溶解氧浓度的样品可能导致溶解氧不足，并产生抑制作用。因此，本方法只能测定包括溶解氧影响在内的综合毒性。
5.4易于生物降解的有机营养物质污染会导致生物发光的减弱或升高。因此，本方法只能测定包括有机营养物质在内的综合毒性。
5.5经消毒处理的生活污水或饮用水中含有余氯，余氯对发光细菌杀灭作用明显，因此在测定不包含氯影响的毒性效应时，应通过加入浓度为0.8mg/L的硫代硫酸钠除氯后再测定毒性。
5.6在初始样品中，加上实验中需要加入的盐之后，含盐浓度超过30g/L氯化钠或者形成同
样渗透压的其他成分，会导致高渗透压。为避免此类干扰，调节渗透压后的样品不应该超过相当于35g/L氯化钠的渗透压。
5.7对于抑制率较高的高毒或剧毒样品，可进行稀释后再次测定其毒性，并记录和报告其稀释倍数和稀释后毒性。
6 试剂和材料
6.1发光细菌
费氏弧菌冻干粉或者明亮发光杆菌冻干粉，毒性测量所用细菌悬浮物来自商业化冻干细菌，可在-20℃储存。细菌在复活以后立即开始生长，并且可以用于测试。使用时需用复苏液将菌种冻干粉复苏活化，置于2-5℃环境中保存，并按照厂家使用说明书使用。发光细菌使用前应先进行质量控制。
6.2 参比用水
蒸馏水或超纯水或经验证过的瓶装水。
6.3 氯化钠溶液
30%（M/V）的NaCl溶液，配制时将30g NaCl固体溶解于100mL的去离子水或由超纯水机制备符合国家标准或行业标准的纯水中。
注：NaCl溶液浓度可根据所用发光菌不同进行调整。
6.4 七水硫酸锌
珍珠岩保温管壳6.4.1 七水硫酸锌母液（ρ氧化锡=1000 mg/L，以Zn2+计）
用万分之一分析天平准确称取密封保存良好的七水硫酸锌4.4154 g移入1000 mL容量瓶，定容至刻度，置于2～5℃冰箱备用，保存期6个月。
6.4.2七水硫酸锌使用液（ρ=2 mg/L，以Zn2+计）
移取2 mL七水硫酸锌母液（6.4.1）于1000 mL容量瓶，定容至刻度。
7 仪器和设备
7.1毒性测定仪。
7.2 测试管（与毒性测定仪可配套使用）。
7.3精密移液器，200 μL和1000 μL。
7.4 天平：精度为0.0001g。标本盒
8 样品采集和处理
8.1样品的采集和保存
取样应该在符合ISO 5667-16标准的化学惰性，洁净容器中进行。完全充满容器并且密封。毒性测定应在采样后6 h内进行。应在2～5℃下保存样品，但不得超过24 h，报告中应写明水样采集时间和测定时间。不要使用化学物质保存样品，进行必要的pH值调节并且在测试之前加入盐。
8.2 样品预处理
测量所有样品的pH值。如果pH值在6～8.5之间，一般没有必要调节。pH值的调节可能改变样品的性质。如果有必要，通过加入盐酸或者氢氧化钠将样品的pH值调节到7.0±0.2；选择盐酸或者氢氧化钠的浓度，以限制加入的体积不多于总体积的5％。若进行pH值调节，在报告里写明水样的原始pH。对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定。
9 分析步骤
9.1 测定条件
环境温度：10-28℃，最佳温度为20±5℃，若仪器自带控温可放宽至仪器测试所需温度范围。
相对湿度：≤90%RH。
所有测试器皿及试剂、溶液应提前达到测试所需温度要求。
电源：电池供电或AC(220±22)V直插。
电源频率：50Hz±1Hz。
9.2 测定模式
9.2.1 国标测试模式
a）打开毒性仪电源，静置等待仪器预热完成。
b）根据不同毒性仪规格按照厂家说明书设定仪器，使适用于国标测试模式。
c）测试管加入盐溶液，用移液器在检测管中加入200 μL氯化钠溶液（6.3）。
钢套箱d）测试管中加入样品，根据测试需求，用1000 μL精确移液器向不同的检测管中加入1800 μL参比水、水样。
e）用200 μL移液器移取50 μL设备防护箱发光细菌（6.1），加入到各个检测管中，迅速将检测管放置于仪器中，利用计时器，读取参比水、水样检测管15 min后的发光强度。
