2019年5⽉的第⼆届基因检测联盟会议召开及会后多⽅讨论达成《遗传病⼆代测序临床检测全流程规范化共识探讨》，近⽇在《中华医学遗传学 pc标牌“实验室检测流程”相关内容。
杂志》四篇同期刊发，本篇⽂章将与⼤家分享“实验室检测流程”
划重点
⽬前临床基因检测实验室尚没有统⼀标准，部分仍沿⽤科研标准进⾏临床检测，亟需规范化，特别是技1.没有精准检测就没有精准医疗，⽬前临床基因检测实验室尚没有统⼀标准，部分仍沿⽤科研标准进⾏临床检测，亟需规范化，特别是技术细节、质量控制、质量评价的具体内容； 2.实验室⾸先应遵守临床相关国内⽂件规范要求，实⾏分区，遵守⽣物安全要求；样本采集、运输与存储应根据不同样本类型进⾏操作，见⽂中表格归纳；
质量控制包括核酸质控、⽂库质控、测序数据质控，特别是⽂库构建需评估试剂有效性，测序需评估不同试剂批次和固定时间间隔下的仪器3.质量控制包括核酸质控、⽂库质控、测序数据质控，
损耗的稳定性；
⾄少添加⼀个阳性质控、⼀个阴性质控或空⽩对照，与常规样本同时检测进⾏质量评4. 样本追踪包括性别⼀致性鉴定和SNP⼀致性鉴定；⾄少添加⼀个阳性质控、⼀个阴性质控或空⽩对照，与常规样本同时检测进⾏质量评价。
实验室NGS检测流程中的质量控制
1.DNA提取、质控、保存与内部转运
对于常规的⼆代测序检测，核酸抽提环节的质量控制需要考虑：DNA的A260/A280值应在1.6~2.2之间，琼脂糖凝胶电泳结果DNA主带明显，⽆明显降解，⽆明显的蛋⽩质、多糖和RNA污染，这些是DNA定性分析结论最基本的要求。
核酸抽取剩余部分的DNA，若客户短期内没有返还样本的需求，建议检测机构对其妥善保管。DNA可短期保存在4℃（4周）或-20℃（1年），长期保存于-80℃（7年），且反复冻融不超过3次。
样本在实验室内部的转运，建议保证标签的⼀致性和可溯源性，采取可识别的编号，同时反映样本的不同状态。
2.⽂库构建及质控
⽂库构建是整个⼆代测序进程中极为重要的⼀环，其质量的好坏将直接影响后续的测序数据质量。⼆代测序技术尽管发展迅速，但基因⽂库的构建⽆论使⽤哪种试剂⽤于临床基因检测，⾸先都应该有⼀套可靠的实验⽅法来评估其有效性，且需要经过仍是⼀项⼗分耗时且复杂的⼯作，⽆论使⽤哪种试剂⽤于临床基因检测，⾸先都应该有⼀套可靠的实验⽅法来评估其有效性，且需要经过⼀段时间的试⽤期来复验。
⽂库构建过程的质控包括：
（1）按已验证的检测流程实施⽂库的构建。⾸先应探索出有效且满⾜建库需求的最低起始建库DNA输⼊值，即检测限度。运⽤液相杂交捕获的⽅法，建议的样本起始量为200 ng；对于扩增⼦捕获实验，则建议以10 ng为起始量；
（2）建议在建库过程中同时设置空⽩阴性对照并使⽤标准品作为阳性对照。标准品可以选⽤商品化的细胞系标准样本或检测实验室已验建议在建库过程中同时设置空⽩阴性对照并使⽤标准品作为阳性对照。标准品可以选⽤商品化的细胞系标准样本或检测实验室已验证过的样本，⽤于监测实验室⽇常检测的可重复性和再现性，以及当批次临床样本检测的有效性；
（3）对构建好的⽂库进⾏质控时，需要根据不同项⽬的要求来监控⽂库的浓度或总量、产物⽚段的长度及分布、阴性及阳性对照的⽂库对构建好的⽂库进⾏质控时，需要根据不同项⽬的要求来监控⽂库的浓度或总量、产物⽚段的长度及分布、阴性及阳性对照的⽂库质检情况，并制定接受或拒绝的标准，以判定批次建库的成功与否。⽂库质控的具体标准需根据检测策略的不同制定出特异性的标准，不能质检情况，并制定接受或拒绝的标准，以判定批次建库的成功与否。
⼀概⽽论。此外，建议将⽂库构建实验的中间产物保存1个⽉。
3.上机测序与质控
saw1测序仪是基因测序的重要⼯具，⽬前市场上的⼆代测序仪主要包括Illumina、Thermo Fisher及华⼤智造等⼚商提供的具有不同通量、读长及研究适配的测序仪器。
<测序时应根据检测的样本量和质量要求，确定适宜的测序平台与⽅案，以保证临床遗传病的⼆代测序数据能够满⾜数据质量及靶向区域覆盖度等需求。实验室应具备满⾜测序仪的正常运⾏所必需的实验室洁净度、温/湿度、防震和光照等条件。
测序质量的参考值为：测序数据的单碱基质量评估指数（Q30）≥ 70%，同时⽂库复杂度的指⽰值重复读数百分⽐（duplication reads rate）也需要控制在⼀定的范围内，⽬标区域的平均深度应根据检测策略对基因变异判定所需的数据深度的需求⽽定。
建议在⼆代测序过程中以固定的时间间隔或在更换试剂批次时，加⼊标准品⽂库的测序与数据质量因涉及仪器损耗与试剂批次间的差异，建议在⼆代测序过程中以固定的时间间隔或在更换试剂批次时，加⼊标准品⽂库的测序与数据质量评估，对测序试剂与仪器的稳定性进⾏评估。
⼆代测序的下机原始数据（BCL⽂件）建议保存0.5 ~ 1个⽉。FASTQ⽂件格式的数据保存的考量应包括原始数据的可溯源性、现有技术（包括测序技术、遗传变异位点处理技术）的版本可溯源性、基于⽬前知识注释解读的可溯源性及患者在⼀定时限内对数据的索取权，保存的时间和⽅式可视不同检测机构的情况⽽定，建议⾄少保存5年。同时，基于数据安全的考虑，应考虑实施必要的防⽕墙、加密
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临床实验室NGS检测的质量评价
每次检测应⾄少添加⼀个阳性质控、⼀个阴性质控或空⽩对照与常规样本同时检测，并设定质控标准，保留质控记录。
通常情况下，每次检测应⾄少添加⼀个阳性质控、⼀个阴性质控或空⽩对照与常规样本同时检测，并设定质控标准，保留质控记录。
同时，应该有计划地采⽤留样复测、相同样本相同⼈员不同时间重复实验、相同样本不同⼈员相同时间重复实验、不同⽅法相同样本的⽐对、设备定期核查等⽅式定期对检测系统的稳定性、仪器设备、⼈员等环节进⾏内部质控。
此外，开展遗传病⼆代测序临床实验室应每年或每两年参加由卫健委或美国病理学家协会（College of American Pathologists，CAP）组织的基因检测能⼒评估考核。作为室间质量评价的参考，如结果不合格，应当分析原因，并采取相应的预防或纠正措施。
总结
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本共识讨论涵盖了将⼆代测序技术应⽤于遗传病基因检测的整个流程。⽬前国内已有许多⼆代测序公司试⽔临床遗传病的检测，⽽对于涉及临床检测的实验室操作尚⽆统⼀的标准。
在临床实验室进⾏的规范化与标准化的检测与质控，有助于使遗传学专家或医师得到精确可靠、准确有效的检测数据进⾏分析，⽣成具有临床指导意义的遗传检测报告，进⾏准确的诊断并实施正确的⼲预和产前诊断等。
尽管国际上发布了⼀些⼆代测序的指南和指导意见，我国也出台了相关的诊疗规范、共识，很多实验室也在遵从ISO 15189质量管理体系标准对实验室进⾏质量管理，但这些指南和意见往往并未涉及技术的具体操作以及如何做好质量控制的细节内容。在我国，⼆代测序临床实验室的质量管理仍有很多细节有待于完善。
本共识将为同⾏业的检测者提供参考，但更多的细节还需要相关的实验室通过不断的沟通与交流，确定普遍适⽤且有效的共识与标准。同时，实验室也应同临床医师与遗传分析⼈员保持互动，沟通内容包括从实验室获得检测技术策略选择的建议、检测技术性价⽐的评估、检测⽅案的适⽤性评价等，共同为遗传病⼆代测序实验室建⽴完善的检测共识，为提⾼遗传诊断检测的⽔平贡献⼒量。
（更详细内容请参阅《中华医学遗传学杂志》2020年3⽉第37卷第3期。）
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