⾸先明确单细胞测序技术不⼀定是⾼通量的，有单细胞测序技术，⾼通量测序技术，包括⾼通量测序技术在内的所有⾼通量技术，⽤于单细胞测序的⾼通量技术。 地脚螺钉如果我们要从技术层⾯理解单细胞测序并分析其优势，就必然绕不开对“单细胞测序”“⾼通量技术”等概念的准确的把握。我们必须搞清楚，当⼀种技术前⾯带了“单细胞”（Single-cell）或“⾼通量”（High-throughput）的字眼时，它们分别代表了什么。
单细胞，就是单个（仅⼀个）细胞的意思。针对单个细胞展开的分析统称为单细胞分析（Single-cell analysis），针对单个细胞进⾏的测序就是单细胞测序（Single-cell sequencing），如果是对多个细胞或者⼀细胞的测序，就不是单细胞测序。⽐如⾯向⼤众的那种测着玩⼉的基因测序，⼀般是取待测者的⾎液，做简单的处理后就直接提取某些DNA⽚段。⾄于提取到的是这⼀个⽩细胞⾥的，还是那个⽩细胞的，⼜或是⾎液中的游离DNA，就⽆从⽽知了。⼜⽐如⼀般的肿瘤研究，通常是对肿瘤组织分离出来的为数不少的肿瘤细胞测序。单细胞测序是⼀种特殊的测序；⽬前，⼤部分的测序都不是单细胞层⾯上的测序。
独⽴的、平⾏的反应的数⽬。这些反应是在不同的容器或反应器⾥的，彼此⾼通量⼜是什么意思呢？通量，你可以理解为⼀次实验时独⽴的、平⾏的
独⽴，互不⼲扰；但⼜是在相同的环境⾥同时（或⼏乎同时）进⾏的，所以说是平⾏的。假设我们对细胞进⾏分析，下图中的试剂与细胞中的某种成分进⾏反应。
（为了⽅便，只画了28个平⾏反应，实际上在⾼通量技术领域，28的通量实在不算⾼。）草甘膦母液
⾼通量技术存在的意义，我认为主要在于它有效地节省了某个实验对⼈⼒物⼒财⼒的耗费。另外，同样的反应同时展开三个以上，可以消除随机性对反应结果的影响，从⽽得到较为严谨的反应结果。
⽐较原始的实现⾼通量的⽅式，是实验室苦⼒们⽤双⼿操作移液，在96孔板或384孔板⾥加各种试剂。但⼿动操作的局限性很⼤，速度也很有限。很有可能加到第100个反应的时候，第100个反应刚开始，第1个反应已经结束了。这样，这两个反应还能称得上是平⾏的吗？⼿动操作达不到很⾼的通量，
于是⾼通量技术逐渐地向机械化、⾃动化的⽅向发展。市⾯上也早已有不少的液体操作机器⼈或点样仪。它们就具备这样的能⼒。
右图是96孔板，有这种底的，也有圆柱体、平底的。
⾼通量技术是⼀种具有普适性的、应⽤范围（可以）很⼴的技术。理想状况下，未来很多的实验，尤其是⽣命科学领域那种涉及⼤量的加液、加液、加液的重复性操作的实验都应该往⾼通量的⽅向发展，这样可以解放科研⼯作者的双⼿，让他们把精⼒留给思考，和真正的科研。就先不提测序，举个例⼦，⾼通量筛选（High-throughput screening，HTS）。
⾼通量筛选技术在药物筛选领域有着不可忽视的应⽤价值。要知道，⼀种药物从合成到真正应⽤到临床的周期有多么漫长。在应⽤到⼈体之前，药物不仅要经过分⼦层⾯的表征，还需要通过细胞实验和
动物实验。细胞实验时，不仅要对药的效果进⾏验证，对药物本⾝进⾏筛选，还需要在众多条件中筛选出最佳的给药条件。这个过程⾮常地laborious，也⾮常地昂贵。⾼通量筛选技术可以缩短筛选所需的时间，提⾼筛选效率。⽐如要从含有300种分⼦的⽂库（library）中筛选出真正有效的药物。如果⾼通量技术能同时进⾏900个平⾏反应（每种分⼦对应3个反应），那么，筛选就可以⼀次完成。
s100无人机
⾼通量测序（High-throughput sequencing）
⾼通量测序（High-throughput sequencing） ⼆代测序（Next-generation
sequencing）是⽬前最常⽤的测序技术，像Illumina的那些测序仪的测序原理就属于⼆代测序的范畴。⼆代测序是在⼈类基因组计划（Human
genome project，HGP）的背景下发展起来的，是⼤规模平⾏的（Massively parallel），寄托了⼈们对 $1,000
genome（把⼀个⼈类个体的全基因组测序费⽤降低到1000美元）的期望。⼆代测序基本上等同于⾼通量测序，其最⼤的意义与其他⾼通量技术的意义相统⼀，就是⼤幅度降低成本，提⾼效率。
不同的⼆代测序技术实现⾼通量的⽅式有所不同。⽐如，454测序技术[1]（后被罗⽒收购，现已淘汰）把DNA碎⽚化，得到DNA⽚段（DNA
fragments）并使之变为单链之后，⽤磁珠捕获这些DNA⽚段，确保one fragment per
bead。然后将这些磁珠包裹到含有PCR试剂的液滴中，进⾏PCR反应，以扩增磁珠上的DNA⽚段。由于液滴是由油相间隔开的，互不⼲扰，因此液滴相当于是微反应器（容纳PCR反应的微型容器），
外墙金属复合板⽽这样的基于液滴的PCR反应是⾼通量的（不同液滴中的PCR反应是独⽴、平⾏的反应）。液滴中扩增的DNA⽚段也被捕获在磁珠上。之后，该测序⽅法会使液滴破裂，收集所有的磁珠，并将磁珠分散到不同的微坑之中，对这些磁珠进⾏同时的、⾼通量的测序。
⽽⽬前最常⽤的Illumina测序仪所采⽤的Solexa测序技术与之不同，不需要⽤到磁珠，过程相对简单。它会事先地在芯⽚内通道的底部修饰两种被称作接头（Adapter）的寡核苷酸，其分别与DNA⽚段两端接上的两段核苷酸互补。然后进⾏桥式PCR，在这种扩增⽅式中，以待测DNA⽚段为模板合成的DNA链由于离通道底部较远的⼀端与附近的接头互补，会向该接头弯曲，并形成“⼀座桥”（桥式扩增以此得名），然后DNA聚合酶以这座桥为模板形成新的链。这样的过程不断重复，最后成簇。由于桥式扩增⾥，某⼀条DNA链只能和最近的接头形成“桥”，所以这些以同⼀条DNA链为模板合成的DNA链只会局限在局部，形成密密的⼀⼩撮，所以说是“成簇”。不同的待测DNA链在不同的位置形成不同的簇（Cluster），起到了聚集并放⼤信号的作⽤。234mm
Illumina测序的桥式扩增
单细胞测序（Single-cell sequencing）
由于⾼通量测序是⽬前最常⽤的测序技术，单细胞测序⽤的测序技术⾃然也以⾼通量测序技术为主。然⽽，单细胞测序并不在⾼通量
单细胞的捕获，⽬标
测序技术及其测序仪上做⽂章，它的难点以及和普通测序的不同之处主要在于测序前的前处理，包括单细胞的捕获，⽬标
DNA/RNA的提取，微弱信号的放⼤（即极少量DNA链的扩增）等等。
DNA/RNA的提取，微弱信号的放⼤（即极少量DNA链的扩增）等等
难点1：单细胞捕获。如何将细胞分散到独⽴的容器或反应器中去，让它们彼此独⽴，互不⼲扰？
难点2：⽬标DNA/RNA的提取。提取不是问题。问题在于，提取时怎样让待测DNA或RNA带上不同的标记，以便测序完了以后还能分辨出来哪些序列是属于同⼀个细胞的？
难点3：信号放⼤。实际测序时，裂解⼀细胞所得到的待测DNA含量都是很低的。⽬前的测序都含有PCR扩增这⼀步，⽽且这⼀步显得相当重要。更何况是⼀个细胞？⼀个细胞中的DNA或RNA简直太少了，稍⼀操作就可能丢失。怎么样能尽量地减少样品损失和扩增时发⽣的偏移和错误呢？
我个⼈的研究⽅向是微流控（Microfluidics）。微流控技术具有精确操控微量液体的能⼒，是⼀种适合应⽤于单细胞分析领域、⽽且已经在这⽅⾯体现了⾃⾝价值的技术。就在这个问题提出之后，没过多少天，2015年5⽉21⽇，同⼀期Cell上发表了两篇相似的、利⽤微流控技术来实现单细胞捕获的⽂章[2,3]。它们均采⽤了微流控领域中经典的⼗字形通道构型。如Drop-seq（下图左），在主通道内引⼊了含有磁珠和逆转录所需试剂的溶液，与之垂直的第⼀组侧通道引⼊了细胞悬液，第⼆组侧通道则引⼊了与溶液不相溶的油相（如矿物油）。油相对⽔相的切割作⽤使溶液被“夹断”，从⽽形成球形的液滴。液滴对磁珠和细胞的包裹基于泊松分布的原理，也就是说，磁珠和细胞是随机地被包裹在液滴中的，但我们可以根据泊松分布，通过稀释磁珠悬液和细胞悬液的密度，以尽可能降低液滴包裹两个（或多个）细胞或两个（或多个）磁珠的概率，并达到较⾼的单磁珠单细胞的捕获概率。虽然这种捕获⽅式⽆法达到很⾼的捕获概率，但鉴于液滴⽣成的速度⾮常快（⼤于100,000/min），因此实现了⾮常⾼的通量。
液滴的⾓⾊是微反应器，你可以把这些不可计数的体积很⼩（纳升级）的液滴想象成是⼀种球形的、柔软的容器。只不过间隔这些容器的不是离⼼管壁，不是塑料，⽽是与液滴不相容的油。但这种“容器”毕竟没有那么稳定；⽽且向这些已经形成的液滴中加⼊其余
磁珠上修饰了引物，引物上除了含有⼀段通⽤的PCR引物，还新的试剂，那是⼀件⾮常难的事情。因此这⾥借助了磁珠的作⽤。磁珠上修饰了引物，引物上除了含有⼀段通⽤的PCR引物，还有⼀段cell barcode，即细胞标记（⽤来标记每个细胞的来源，不同的细胞有不同的barcode），同⼀个磁珠上的引物带有相同的cell barcode，⽽不同磁珠之间的barcode则是不同的。另外⼀段UMI（Unique molecular identifier），是⽤来标记分⼦的，每⼀条引物都有它特定的UMI(标记mRNA ⽤处：PCR扩增之前的重复需要保留，PCR扩增之后的重复需要去除。怎么实现呢？UMI(Unique Molecular Identifier)数字标签技术这时候就派上⽤场了，只要在PCR扩增之前给每个分⼦加上⼀个特有的标签，之后⽆论经过多少个循环的扩增，这个标签都⼀直伴随着同步进⾏复制，最后可以通过UMI的种类对真重复和假重复进⾏区分，从⽽达到去除扩增重复的⽬的)。曲度腰枕仪
当⼀个磁珠和⼀个细胞被包裹于⼀个液滴微反应器中，液滴中含有的细胞破膜剂使细胞破裂，释放其内容物，磁珠即捕获了该细胞的某些RNA。之后就只需取出这些磁珠，对这些磁珠进⾏逆转录、PCR扩增、测序等过程。由于每条分⼦都已经含有UMI和cell barcode，这些操作都可以⽤常规的⽅式，在离⼼管中统⼀进⾏。
这两篇是单细胞RNA测序，⽽单细胞DNA测序⾯临更严重的样品太少、容易损失的问题。单细胞DNA测序对于扩增⽅法的均匀性和准确性有更⾼的要求，在这⽅⾯微流控技术也发挥了它的作⽤。⽐如2015年9⽉发表在PNAS上的⼀篇⽂章[4]，先是⽤显微操作取了⼀个细胞到⼩离⼼管⾥，使细胞裂解。然后也⽤⼗字形微流控通道使单细胞裂解产物⽣成液滴，并尽量保证每个液滴中含有0或1条DNA 分⼦。将DNA分⼦分散到独⽴的液滴微反应器之后再进⾏的扩增反应具有更好的均匀性，更有利于单细胞全基因组测序。
以上是背景。现在我再来正⾯回答⼀下这个问题。
单细胞测序具有诸多的难点，涉及到⼀系列不同的技术，它更多地是代表了⼀种研究⽅向。我们只有在讨论某⼀项具体的技术或产品时才会去⽐较它的优势和劣势。
对于单细胞测序，我们似乎更应该着眼于它的“研究意义”和“研究价值”。单细胞测序那么难做，为什么还要去做它呢？实际上，包括单细胞测序在内的单细胞分析的意义，现在还存有争议。我就认识⼀位⽼师，他不太认同单细胞分析的意义，觉得没必要对单个细胞进⾏如此深⼊的分析。但随着单细胞相关的研究越来越普遍，越来越深⼊，应该会有越来越多的⼈认可它的意义。
单细胞测序的意义的根本在于细胞的异质性（Heterogeneity）。就是说，细胞与细胞之间存在个体差异性，即便是出于同⼀位置的细胞，也可能在基因表达等⽅⾯存在⼀些差异。对细胞体的研究，只能得到这细胞平均化的结果。⽽这结果是掩盖了细胞异质性的。两个具体的例⼦。
⼀是细胞分类。那篇Drop-seq的切⼊点就是细胞分类系统。以往我们在对细胞进⾏分类时，往往依据的是细胞的空间位置、形态等特性，这种分类⽅式相当地简单粗暴。进⾏单细胞⽔平的RNA测序或DNA测序，有助于实现更为细致和严谨的细胞分类，尤其是对于⽐较复杂的组织，单细胞测序能促进⼈们更深⼊地了解细胞与细胞的功能。
⼆是肿瘤相关的研究。现在⼀个认可度⽐较⾼的关于肿瘤转移的假说是，肿瘤上某些细胞会从原位脱落，进⼊⾎液循环，成为循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）。有些CTCs可能会顺着⾎液流到某个器官，侵⼊⾎管，侵袭该器官，附着，增殖，长出新的肿瘤。那么，原来那颗肿瘤⾥哪些细胞会成为CTCs，⽽CTCs中哪些可以在⾎液循环中存活下来，并且完成肿瘤转移呢？这些具备超乎寻常的能⼒的CTCs和寻常的CTCs之间有什么区别？这就需要单细胞层⾯上的测序和其他相关研究了。
⽬前，单细胞测序或其他的单细胞研究看似是不太“实⽤”的研究⽅向。但它代表着⼈们已经注意到了细胞的异质性，开始关注细胞个体⽽⾮体，代表了⼀种更深⼊的视⾓，⼀种更精准地理解⽣命的可能性。仅从这个⽅向来想，其实，我就觉得它够有意义的了。
