******大学
序列的PCR扩增
实验项目性质： 综合性实验
计 划 学 时： 课程实习
班 级：
姓 名：
学 号：
指 导 教 师：
2010 年 5 月26日
摘 要
本实验通过碱裂解法提取并纯化大肠杆菌DH5α（含重组了约500bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）中的质粒DNA，并对该质粒DNA进行双酶切及目标序列的PCR扩增，学习并掌握基因工程操作中最常用的载体质粒文件传输
DNA提取方法及其纯化技术、DNA酶切分析实验的基本操作和PCR实验操作技能，理解限制性内切酶的特点，加深对聚合酶链式反应的原理的理解。结果显示，提取的质粒DNA量较多，且含有插入目的片段，但仍伴有大分子DNA碎片，提取纯化质粒DNA的操作有待提高。本文为基因工程中质粒DNA提取和纯化等提供一定的参考价值。 关键词：质粒DNA 双酶切 PCR
1、 前言
质粒 ( Plasmid)是一种染体外稳定的遗传因子，大小从 1～200 kb不等，为双链、闭环的 DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细
胞中，它具有自主复制和转录能力[1]，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中进行繁殖和表达，是分子生物学试验中常用的工具[2]。
质粒DNA 是基因工程的常用载体。大肠杆菌因其易操作，发酵周期短，备受分子生物学工作者的青睐。因此，大肠杆菌质粒DNA 的提取成为分子生物学实验中最基础和最重要的工作。质粒的质量关系到分子克隆的全过程。目前 ,常用的质粒提取方法除了有碱裂解法[3-4]、煮沸法等，还有许多改进的方法报道(如贺竹梅[5]、李云峰[6]等)。同时各试剂公司也开发出多种质粒提取试剂盒。本文以碱裂解法提取质粒DNA并进行纯化，分别以双酶切与PCR技术检验提取的重组质粒中是否含有插入的目的片段。
2、 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验材料
大肠杆菌DH5α（含重组了约500bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）
2.1.2 实验试剂
LB培养基，3mol/L醋酸钾（pH5.2），TE缓冲液（pH8.0），无水乙醇，75%乙醇，RNaseA（10mg/ml），goldview DNA染剂，氯仿，琼脂糖；
BamHI（1 U /μL）、无线抄表HindⅢ（1 U /μL）、10×K buffer、6×上样缓冲液、0.5×TBE等；
1U/μL的 Taq酶，10 × PCR buffer，1 mmol/L 的dNTP，克隆基因特异引物F1、F2（各1µmol/L），marker DNA，ddH2O。
● 抽提质粒DNA所需的溶液：
溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；
溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用；
溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；
● 电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；
● PCR扩增引物：
PF：5`—CCAAATGGTTGTATGGTGTT—3`
PR：5`—CTATCCAACAATCTTGGAAA—3`
2.1.3 实验仪器
高压灭菌锅，超净工作台，恒温摇床，台式离心机，涡旋振动器，培养管，移液器，1.5ml的离心管，吸管头， 0.2ml的PCR管，PCR仪，冰盒，量筒，制胶模，电泳仪，紫外观测仪等。
2.2 实验方法
2.2.1 碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化
（1）质粒DNA的提取：
① 在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜；
2 取1mL菌液放入1.5mL Ep管中，5000 r/min（简写rpm）离心2min；弃尽上清；
3 加入150μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀，悬浮菌体；
4 加入250μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；
5 加入180μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－80℃放置5min；
6 12000rpm离心8min；
7 吸上清550μL至另一新的1.5mL EP管，加等体积氯仿充分混匀，12000rpm离心5min；
8 小心移取上清液150μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-80℃静置10min，12000 rpm辊道窑
离心5min，弃上清； （静置期间制1%琼脂糖凝胶） 9 加入300μL 70%乙醇洗DNA沉淀，弹离心管壁至DNA沉淀悬浮，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心1min，用移液器尽可能除去乙醇，通风橱适度风干；
10 加入30μL RTE （含20μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA， 37℃放置1h；
11 取10μL质粒DNA溶液于另一干净离心管中，2μL上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中；
12 打开电源开关，调电压为80~100伏进行电泳；
13 电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。
（2）1％琼脂糖凝胶的制作：
以制30mL量的琼脂糖凝胶为例，具体过程如下：
① 称量0.3g的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中；
② 加入30mL 0.5×TBE于三角瓶中，称出总重量并记录；
③ 在微波炉中充分溶解（约1分钟），称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量；
薯片加工设备④ 室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度，此时再加入1.5μL goldview染料(原则上按照100mL琼脂糖液加goldview染料3-5μL)压铸机料筒的设计，混匀；
⑤ 把混合液倒入一已插入梳子的制胶模具中，让其自然充分凝固（一般需要20分钟以上）；
⑥ 小心拔掉梳子，把凝胶连同胶膜一起转移到电泳槽中（TBE缓冲液的添加以没过胶面1～2毫米为宜），即可用于点样和电泳检测。
2.2.2 质粒DNA的双酶切分析
（1） 在一1.5mL离心管中配制质粒双酶切反应液：（反应体系为20µL）
各成分如下：
质粒DNA 10μL
10×Buffer 2μL
BamHI（1U/μL） 1μL
HindⅢ（1U/μL） 1μL
ddH2O 补水至20μL
用移液器tip头轻轻混匀
（人脸识别智能门禁2） 30℃恒温条件下酶切反应约2h （酶切过程中，制备1％的琼脂糖凝胶）；
（3） 酶切结束后，往酶切反应管中加入4μL 6×上样缓冲液，轻轻混匀；
（4） 取全部酶切液点样于琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL标准分子量 marker DNA；
（5） 接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟；
（6） 切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果；
2.2.3 聚合酶链式反应（PCR）
（1） PCR反应液配制：反应体系为25µL （请先计算出如下各成分所需加入的量）
反应液组分 | 起始浓度 | 25µL反应体系所需量 |
反应buffer | 10× | 2.5μL |
dNTP mix | 1mmol/L | 2μL |
引物F1 | 1µmol/L | 2μL |
引物F2 | 1µmol/L | 2μL |
DNA模板 | 提取的质粒 | 取质粒DNA提取中步骤10中的质粒DNA溶液1μL |
Taq酶 | 1U/µL | 1μL |
无菌水H2O | — | 补水至总体积25µL，混匀盖上盖 |
| | |
（2） 在PCR仪中运行如下PCR反应程序，实现DNA的扩增：
90℃ 30min→90℃ 30s→48℃ 40s→72℃ 1min→72℃ 10min
↑ 20循环 ↑
（3）PCR扩增过程中，制备1％的琼脂糖凝胶；
（4）PCR结束后加入5µL上样缓冲液，混合均匀并全部上样于1％琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL marker DNA做标准分子量大小对照；
