Western-Blot操作流程
试剂配制
nnn161.RIPA裂解液：
50mM Tris（MW121.14，PH7.5）3.02g
150mM NaCl 4.38g
1%TritonX-100 5ml
1%脱氧胆酸钠5g
0.1%SDS 0.5g
蒸馏水至500ml。
调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 2. 蛋白酶抑制剂cooktail
自制纳米胶带教程
所需母液成分：
筋膜放进B里面
（1）100mmol/L PMSF
PMSF 17.4mg
异丙醇1ml
（2）10mM 亮肽素leupeptin:-20℃保存
（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin:4℃保存
配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量oled tft
PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ul
Leupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ul
Aprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul
各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。
1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）
考马斯亮蓝G250 100mg
95％乙醇50ml
85％磷酸100ml
蒸馏水至1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕瓶中。
2．牛血清白蛋白B SA储存液（1mg/ml）：
100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。
1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2ml
SDS 0.8g
溴酚蓝0.04g
甘油4ml
去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。使用时稀释成1X。2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）
用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，分装成1ml小份储存于-20 C。使用时稀释成1X。
例如：上样量20μl--4X上样缓冲液5μl+ DTT 2μl + 样本蛋白13μl
制胶用（1-6）：
1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8）
Tris (MW121.14) 12.114g
蒸馏水100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。
2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 18.671g
蒸馏水100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。
3.10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至100ml
如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4.10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺0.1g
蒸馏水1ml
（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）
5．四甲基乙二胺原液（TEMED）：4 C保存。
录入笔6．30%丙稀酰胺：4 C保存。
10%下层胶（两块胶，15ml）：
依次加入去离子水 5.9ml
30%丙烯酰胺5ml
1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml
10%SDS 150μl
10%AP 150μl
TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加正丁醇（1ml）消泡
5%上层胶（两块胶，6ml）：
依次加入去离子水4.1ml
30%丙烯酰胺1ml
1M Tris-HCl（pH6.8）0.75ml
10%SDS 60μl
10%AP 60μl
TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
7．5X电泳液缓冲液
Tris（MW121.14）15.1g
甘氨酸（MW75.07）94g
SDS 5.00g
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存，用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。
8．10X转膜缓冲液
甘氨酸（MW75.07）151.1g
Tris（MW121.14）30.3g
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存，用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。
通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）
9．10XTBS缓冲液
Tris（MW121.14）24.2g
NaCl 80.0g
蒸馏水至1000ml
（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。
10．1XTBST缓冲液
10XTBS缓冲液100ml
蒸馏水900ml
Tween-20 1 ml
因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把头剪掉一块，即可防止产生气泡。
溶解后室温保存。
11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：
陶瓷缸套1XTBST缓冲液95-100 ml
脱脂奶粉5g
溶解后4℃保存，可于一周内使用。
