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ELLMAN试剂测定自由巯基
试验基于的原理：
5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)
5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。 DTNBTNB2-
根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，
ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.
我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：
1.磁悬浮支架图片
EDTA的适量加入有助于TNB显的稳定和成梯度线性关系[5]。 2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不 3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在
5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].
试验方案
主要材料：
1.材料
PEG-G-CSF批号：080229浓度4.32mg/ml
G-CSF批号：080126浓度6.9mg/ml
10k超滤膜PALL
2.试剂
SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。20ug/小瓶。加入20ul50mMNH4HCO3，pH7.8溶解，配成1ug/ul的酶液。
1MDTT刘春凤提供
TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114
乙腈：FisherScientificLot#055848
StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-208241-001(includingα-Cyano-4-hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibrationstandardI,proteincalibrationstandardⅡ)
太阳能电池背板
PEG肽段反相分离流动相
A液：0.1%TFA/H2O
B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O
3.仪器
质谱仪：BRUKERDALTONICSMALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号KC2007-011)
Beckman22R台式离心机（厂内编号AM-039）
BeckmanDU-800紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）
衣帽恒温循环仪：JULABOF12-ED（厂内编号KC2008-003）
反相柱：SymmetryC185um300à4.6*150mm，LotNO
高压液相仪器：，（UV/VisibleDetector）
试验过程：
一、缓冲液替换
PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mMNH4HCO3，pH7.8。使用50mMNH4HCO3作为空白对照，样品用50mMNH4HCO3稀释一倍后在DU-800紫外分光光度计上测浓度。
PEG-G-CSF的浓度约6.29mg/ml，G-CSF的浓度约10.81mg/ml。
二、酶切处理
1）取37ulG-CSF,共400ug，加入125.5ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。
取63.ulPEG-G-CSF,共400ug，加入152ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。
2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10ul，同时各加入1ul1MDTT使终浓度为5mM。另做一空白对照，往300ul50mMNH4HCO3中加入Trypsin15ul。
37℃反应，开始时间为。
三、肽段反相分离
Time | Flow | %A | %B |
0 | 1 | 100 | 0 |
1 | 1 | 100 | 0 |
15 | 1 | 68 | 32 |
45 | 1 | 65 | 35 |
50 | 1 | 54 | 46 |
70 | 1 | 49 | 51 |
80 | 1 | 20 | 80 |
85 | 1 | 100 | 0 |
95 | 1 | 100 | 0 |
| | | |
G-CSFTrypsin+DTT反相分离
收样：
Time | Flow | %A | %B |
0 | 1 | 100 | 0 |
1 | 1 | 100 | 0 |
15 | 1 | 68 | 32 |
45 | 1 | 65 | 35 |
50 | 1 | 54 | 46 |
70 | 1 | 压缩空气喷嘴 49 | 51 |
80 | 1 | 20 | 80 |
85 | 1 | 100 | 0 |
95 | 1 | 100 | 0 |
| | | |
PEG-G-CSFTrypsin+DTT反相分离
收集到之间的信号峰，交由崔文喜冻干
四、ELLMAN试剂测定自由巯基
由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。
根据我们所查到得文献，采用的参数如下：
反应缓冲液：0.10M磷酸钠+0.001MEDTA，pH7.27
温度：25℃
在这些参数下，摩尔吸收光系数为14.15±0.09*103LM-cm-[9].
1)标准曲线
用反应缓冲液配制10umDTT，20umDTT，40umDTT，80umDTT，160umDTT，320umDTT。用缓冲液配制10mM的ELLMAN试剂。准备两个比皿。
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值ADTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为Afinal。
④A412nm=Afinal-（3.1/3.2）(ADTNB-Abuffer),制作标准曲线。
2）样品巯基测定
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值ADTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为Afinal。
④A412nm=Afinal-（3.1/3.2）(ADTNB-Abuffer)，根据标准曲线测定巯基。
参考文献：
1)THEODOREW.Tetal.SensitiveQuantitativeAnalysisofDisulfideBondsinPolypeptidesandProteins.ANALYTICALBIOCHEMISTRY138,181-I88(1984).
2)W.L.ANDERSONANDD.B.WETLAUFER.ANewMethodforDisulfideAnalysisofPeptides.ANALYTICALBIOCHEMISTRY67.493-502(1975).
3)Ellman,G.L.,Arch.Biochem.Biophys.,74,443.(1958)美容喷雾器.
4)PeterEyer,etal.Molarabsorptioncoe?cientsforthereducedEllmanreagent:reassessment..AnalyticalBiochemistry312(2003)224–227
5)W.L.ANDERSONANDD.B.WETLAUFER.ANewMethodforDisulfideAnalysisofPeptides.ANALYTICALBIOCHEMISTRY67.493-502(1975).
