尿液中囊泡的提取和鉴定概要

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尿液中 exosome 的提取和鉴定

一、 exosome的提取

（一）实验准备

1.试剂： Sigma P2714 ，三乙醇胺， NaOH ，蔗糖，去离子水耗材：超速离心管 50mL ， 15mL

2.配制 Isolation solution 50 mL

1.	10 mM Triethanolamine （三乙醇胺）（ MW 185.7 ）			0.093 g
2.	250 mM Sucrose （蔗糖）（ MW 342.3 ）			4.28 g
3.	加去离子水	至		45 mL
4.	1 M NaOH	调 pH 至 7.6		~220 μ L
5.	加去离子水	至机读答题卡		50mL
6.	加 protease inhibitors day of isolation
3.	3. 5× SDS-Laemmli for Western Blot		50 mL
1.	SDS		3.75g
2.	Glycerol		15 mL
3.	1 M Tris-HCl ， pH 6.8		2.5 mL
4.	Bromophenol 溴酚蓝		dab
5. DTT			60 mg/mL
折叠浴巾架 6.	去离子水至		50 mL

（二）		微波烘箱实验步骤 (Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010)
1.	将－	80℃冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在			50mL离心管中。
2.	从 -20	℃中取出 Sigma P2714		蛋白酶抑制剂，加入	5mL二次水混匀。
3.	每 50mL尿液中加入		625 μL 溶解后的蛋白酶抑制剂（ 12.5			μ L/mL Urine ）。
4.	于 4℃， 17000 × g		离心 15 min 。（新鲜尿液 25℃离心）			（超速离心机型号 Hitachi CP
80MX）
5.	取上清液置于超速离心管中，装			3 管，每管分装	8mL， 4 ℃ 200 000		× g 离心 1 h 。（同
上新鲜尿液 25℃）

6.离心后弃上清，再取 17000 × g 上清各 8mL分置 3 管中，同上述条件离心。

7.弃上清， 3 管中各加 50μ L isolation solution ，涡旋混匀 30 s，转移到一个 1.5 mL Eppendrof

离心管中。

8.加 1 mL 200 mg/mL DTT 95 ℃孵育 2 min

9. 将上述溶液转移至高速离心管中，并加入

离心 10min。

10. 弃上清，加 50 μ L isolation solution

。

8 mL isolation solution 17000

溶解沉淀物，在 17 000 ×

离心

g 超高速

15 min 。

取上清做 1D SDS/PAGE.

11.Bradford 法测蛋白总浓度。

12.按 1:4 体积比加入 5× SDS-Laemmli 缓冲液（含 60 mg/mL DTT ），涡旋混匀。

不锈钢表面钝化

13.60 ℃加热 10 min ， -80 ℃保存。（ for western blot					）
朱墨桃师提取			exosome 方法 (Zhu, Li et al. 2012)
1.	2,000 g for 10 min at 4			°C ，除细胞；
2.	取上清， 4	°C	10,000 g 细胞培养工作站	离心 30 min ，除去细胞碎片；
3.	取上清， 4	°C	110,000 g	离心 70 min ，弃上清；
4.PBS 清洗并重新分散， - 80 °C保存。
5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)						测定蛋白含量。

二、负染电镜分析

（一）实验准备

4%paraformaldehyde 多聚甲醛（303cin PBS，pH 7.4 ），1 %Uranyl acetate 乙酸双氧铀 in dd-H2O，石蜡膜， 200 目镍网

（二）实验步骤

1.	将 20μ L exosomes 小体悬样与	4% 多聚甲醛（ in PBS ， pH 7.4	）1： 1 混匀。
2.	取 10μ L 混合物滴于石蜡膜上，将	200 目镍网置于液滴中悬浮	10min。

3.用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。

4.在 20μ L PBS 液滴中悬浮 5min，重复。

5.在 20μ L 去离子水液滴中悬浮 5min，重复。

6.1% 乙酸双氧铀负染液负染 1 min ，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。

7. 将镍网正面朝上置于滤纸上，在有盖的玻璃皿中干燥 15min 。

8.样品准备完毕，进行 EM分析。

三、 1D SDS-PAGE

（一）实验准备

储存液配制：

（1） 2 M Tris-HCl

（2） 100 g/L SDS 溶液

（3） 75%（v/v ）甘油

（4） 10 g/L 溴酚蓝溶液

电泳工作液配制：

（1） Acr-Bis 液

（2）4×分离胶缓冲液

（3） 100 g/L 过硫酸铵溶液

（4） TEMED成品液

（5）5×样品缓冲液

（6）10×电泳缓冲液

本文发布于:2023-06-25 17:29:52，感谢您对本站的认可！

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