王静莹;薄海波;吉生军;程子毓;陈秀红
【摘 要】A high performance liquid Chromatography method for the determination of uric acid,guanine,hypoxanthine,xanthine and adenine in meat was established and applied.The detecting method for Chromatography was:Shiseido CAPCELL PAK-C18 (4.6 mm × 250 mm,5 μm) column,column temperature was at 30 ℃.The mobile phase was 7 × 10-3 mol/L KH2PO4-H3PO4 (pH =3.83)at a flow rate of 1.0 mL/min.The UV detector was used and the wavelength was set at 254 nm and the Sample volume was 10 μL.Result:Under the above conditions,good separation was obtained and four kinds of purines and uric acid was showed in the range of 0.05-50 μg/mL;a good linear relation was observed between the concentration and peak area,and all the correlation coefficients are higher than 0.9996,the limit of detection was between 0.010-0.024 g/mL,precision detection of RSD％ was between 0.25％-0.81％,the recovery rate of each component was between 92.0％-105.0％,the precision RSD％ was between6.27％-11.09％.Conclusion:The method
was simple,rapid and reliable,had a good separation for each component,and can be used for the analysis and determination of purine and uric acid in meat products.%建立同时测定肉类食品中尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤的高效液相谱分析方法,并测定肉类样品中上述4种嘌呤及尿酸的含量.谱条件:资生堂CAPCELL PAK-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)谱柱,柱温30℃;流动相为7×10-3 mol/L KH2PO4-H3PO4(pH =3.83),流速1.0 mL/min;检测器为紫外检测器,检测波长254 nm;进样量10 μL.结果:在上述条件下4种嘌呤和尿酸分离和测定效果良好,4种嘌呤和尿酸的质量浓度和峰面积在0.05 ～ 50 μg/mL线性范围内线性关系良好,相关系数均在0.999 6以上,检出限在0.010～0.024 μg/mL之间,精密度检测RSD为0.25％ ～0.81％,各组分回收率为92.0％～105.0％,方法精密度RSD为6.27％ ～11.09％.结论:该方法简便,快捷,可靠,各组分分离度好,可应用于肉类食品中嘌呤和尿酸的同时分析测定. 【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2017(043)004
【总页数】6页(P232-237)
取样方法【关键词】高效液相谱(HPLC);牛羊杂碎;嘌呤;尿酸
骨灰戒指【作 者】王静莹;薄海波;吉生军;程子毓;陈秀红
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【作者单位】青海师范大学,青海西宁,810000;青海师范大学,青海西宁,810000;青海师范大学,青海西宁,810000;青海师范大学,青海西宁,810000;青海省出入境检验检疫局,青海西宁,810000
测试网页游戏【正文语种】中 文
嘌呤(C5H4O4)是一类生物碱，是核酸的重要组成部分，人体内嘌呤的主要来源有体内合成、人体组织中核酸分解以及食物中摄取，而饮食是人体嘌呤的一个重要来源。常见的嘌呤主要有腺嘌呤(adenine)、鸟嘌呤(guanine)、黄嘌呤(xanthine)和次黄嘌呤(hypoxanthine) 4 种[1]，嘌呤经体内代谢最终转化生成尿酸(Uric acid)，正常情况下主要经肾排出体外。尿酸是人体内特有的天然水溶性抗氧化剂，具有刺激树突状细胞及T细胞成熟以维护机体免疫力、维持血压、促进伤口愈合等功能[2]。长期摄入高嘌呤的食品再加上一些诱导因素会导致嘌呤在体内的最终产物——尿酸的沉积，最终引发痛风。螺旋湿喷机
食品嘌呤含量的检测方法和样品前处理方法多种多样，目前国内外没有建立统一的标准。嘌呤检测的方法主要有液相谱法、纸层析法、电泳法、薄层谱法、气相谱法和离子谱法等[3]，随着液相谱法日渐普及，并因其方便、快速、灵敏、选择性高，已成为检测嘌呤的主流方法。样品中嘌呤的提取方法有酸提取法[4-7]、有机溶剂萃取[8-9]和超声辅助萃取法[10-12]。研究者多采用HClO4[13-19]、三氟乙酸和甲酸[20-21]进行样品水解。HClO4水解样品，分离效果较好,准确度和精密度较高,检测时间短。因此本实验采用高氯酸对样品进行水解。
本研究建立了同时测定青藏高原牛羊杂碎等风味肉制品中腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤及尿酸的高效液相谱分析方法，并对4种嘌呤和尿酸含量进行同时测定。
1.1 材料与试剂
样品：新鲜黄牛肉、牦牛肉、手抓羊肉、牛肉、牛头肉；牛腩、牛肚、牛筋、羊肝、羊心、羊肠等牛羊内脏；牛杂碎(含有牛肚，牛筋，牛肺，牛肠，牛腩等内脏)、羊杂碎(含有羊肚，羊心，羊肺，羊肠，羊肝等内脏)购自西宁市各大市场。-20 ℃冷冻保存。
标准品：尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤标准品(纯度>98.0%)，Agilent公司。
称取尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤标准品各0.050 0 g，加20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液助溶，分别用10%甲醇溶液定容至100 mL容量瓶中，摇匀，即得500 μg/mL的标准单一储备液。-20 ℃保存。
试剂：甲醇(谱纯)，天津市光复精细化工研究所；HClO4(分析纯)，天津东方化工厂；KH2PO4(分析纯)，北京红星化工厂；H3PO4(分析纯)，天津市滨海科迪化学试剂有限公司；KOH(分析纯)，四川成都化工厂；实验用水均为超纯水。
1.2 仪器与设备
U1tiMate3000高效液相谱仪(配有紫外检测器)，美国戴安公司；FW-100高速万能粉碎机，绍兴市科弘仪器有限公司；雷磁PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；L600离心机，湘仪公司；WB-2000水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；TG332A微量分析天平，湘仪天平仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 谱条件
谱柱：资生堂CAPCELL PAK-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温30 ℃；流动相：7×10-3 mol/L KH2PO4-H3PO4(pH=3.83)，流速1.0 mL/min；检测器：紫外检测器，检测波长254 nm；进样量10 μL。
1.3.2 样品的制备与前处理
将样品室温下自然解冻，新鲜黄牛肉、牦牛肉、手抓羊肉、牛肉、牛头肉等肉类和牛腩、牛肚、牛筋、羊肝、羊心、羊肠等牛羊内脏；用刀切碎，再用高速万能粉碎机绞碎并匀浆，贴明标签，-20 ℃冷冻保存备用。
将市购的牛杂碎(含有牛肚，牛筋，牛肺，牛肠，牛腩等内脏)和羊杂碎(含有羊肚，羊心，羊肺，羊肠，羊肝等内脏)分别分样为牛杂碎肉(干物质)、牛杂碎汤、牛杂碎肉和汤(混合物)、羊杂碎肉(干物质)、羊杂碎汤、羊杂碎肉和汤(混合物)，用高速万能粉碎机绞碎并匀浆，贴明标签，-4 ℃冷冻保存备用。
称取0.200 0 g样品于10 mL具塞刻度离心管中，加入3 mL 体积分数10%的HClO4，摇匀后在沸水浴中水解60 min，冷却。用1 mol/L的KOH溶液调节pH至3.8，再用超纯水定容至10
mL，以3 000 r/min的转速离心30 min，上清液滤纸过滤，再用0.22 μm微孔水膜过滤，待进样分析。
2.1 实验条件的优化
2.1.1 谱柱的选择
CAPCELL PAK-C18柱采用高纯度多孔球形硅胶作为基质，表面包覆单层有机硅聚合物薄膜，并在其上键合十八烷基(C18)等各种官能团的高性能填料填充的谱柱。该填料既具有硅胶类填料的高分离能力，又具有聚合物填料的耐久性。该谱柱适合测定极性成分，能与极性较强的水流动相兼容使分离的各组分呈现出良好的谱峰形。实验结果表明：使用资生堂CAPCELL PAK-C18能将4种嘌呤和尿酸完全分离。
2.1.2 检测波长的选择
尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤都有着共轭双键，在紫外区220～300 nm之间有强吸收峰。综合考虑4种嘌呤和尿酸的吸收峰，选择以波长254 nm作为实验检测波长。
2.1.3 流动相的优化
2.1.3.1 流动相pH的选择
流动相的酸度对嘌呤类物质的分离程度和保留时间影响较大，应选择合适的pH值使4种嘌呤和尿酸达到最佳分离效果。考察了浓度相同(7.0×10-3 mol/L)，不同pH(3.65，3.83、3.93、4.15)的KH2PO4- H3PO4溶液对4种嘌呤及尿酸峰形和分离效果的影响。见图1。
观察上图中4种嘌呤和尿酸的分离情况结果，在pH为3.83时，4种嘌呤和尿酸可以完全分离，而且基线稳定，重复性最好，出峰顺序依次为尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤。因此确定流动相pH为3.83。
2.1.3.2 流动相浓度的选择
采用KH2PO4- H3PO4溶液做流动相，考察了相同pH(3.83)，不同浓度(2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2 mol/L)的KH2PO4-H3PO4溶液对4种嘌呤及尿酸峰形和分离效果的影响，见图2。
观察上图中4种嘌呤和尿酸的分离情况，流动相的浓度对于峰形、分离度影响较大。在浓度7.0×10-3 mol/L的情况下，基线较稳定，分离度好。因此最终确定流动相浓度为7.0×10-3
mol/L[22]。
水泥装袋机2.2 线性范围及检出限、定量限
分别移取500 μg/mL标准单一储备液,用超纯水稀释至0.05、 10、 20、30、40、50 μg/mL的标准系列混合溶液。将系列标准混合溶液分别用0.22 μm微孔滤膜过滤至进样瓶中, 在1.3.1所述的谱条件下，各进样10 μL，绘制标准曲线。
采用外标法对进样的系列标准溶液的峰面积和相应质量浓度进行线性回归计算，得峰面积(Y)与质量浓度(X)的线性方程和相关系数。按3倍信噪比计算检出限(LOD)，10倍信噪比计算定量限(LOQ)。数据结果见表1。
表1数据结果显示：4种嘌呤和尿酸的质量浓度和峰面积在0.05～50 μg/mL线性范围内线性关系良好，相关系数(R)在0.999 6～0.999 9之间，检出限在0.010～0.024 μg/mL之间。说明此方法适合实际样品的测定。
2.3 精密度考察
将20 μg/mL的混合标准溶液在日内连续进样6次，根据定量的质量浓度分别计算4种嘌呤和尿酸的精密度。数据结果见表2。
表2数据结果显示：尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤的相对标准偏差为0.25%～0.81%,精密度良好。
2.4 回收率考察
采用牛肚作为实验样品进行添加回收率实验，取已知4种嘌呤和尿酸含量的牛肚样品18份，每份0.200 0 g，加入3个不同浓度水平的四种嘌呤和尿酸的标准混合溶液,每个浓度水平平行6份，按照1.3.2节中的前处理方法进行处理后,根据添加的标准样品质量浓度和测定出的加标样品质量浓度计算4种嘌呤和尿酸的回收率，尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤的平均加标回收率分别为99.1%、99.0%、105.0%、92.0%、92.6%，根据实验测得的18份加标样品中4种嘌呤和尿酸的回收率，计算出方法精密度RSD为6.27%～11.09%，均符合分析测定的要求。
