王鑫;苏丹;李海波
【摘 要】A strain autochthonous fungus and a strain bacterium identified as Bacillus sp. and Mucor sp. They were isolated from a contaminated soil and were studied for their co-immobilization. The co-immobilization carrier and the method were investigated,which could used for screening degrade benzo[a]pyrene (BaP) in the contaminated soil efficiently. The results indicated that the degradation rates of BaP by Bacillus sp. SB02, were 33.0％ in 42 days, when the initial concentrations was 50 mg·kg-1 in soil. The degradation rates per day of BaP Mucor sp. SF06 were 69.7％ in 42 days. The degradation rate of BaP by Mucor sp. SF06 was the most rapid. The optimum immobilized carrier was modified vermiculite, and it is better mass transferred. It could degrade 95.32％ of BaP in 42 days, which was remarkably higher than the degradation rate of that by the free strains. The microstructure of immobilized mixture microorganism was observed by scanning electron microscope (SEM). Also, the process of the transmission in soil was discussed.%研究了3株细菌与3株
真菌对土壤中苯并芘(BaP)的降解动态,从中筛选出l株细菌(Bacillus sp.)和l株真菌(Mucor sp.),并采用吸附法将混合菌固定在改性后蛭石上,研究了固定化混合菌对土壤中BaP的降解效果.结果表明:细菌中芽孢杆菌(Bacillus sp.,SB02)降解率最高,42 d对B[a]P的降解率为33.0%,降解速率也最快,l周可降解12.6%的BaP;真菌中毛霉(Mucor sp.,SF06)降解率最高,42 d对B[a]P的降解率为69.7%;以改性后蛭石为载体用吸附法制得的固定化混合菌,传质性能好,对BaP的降解率42d可达95.32%,高于游离菌20个百分点. 【期刊名称】《生态环境学报》
【年(卷),期】2011(020)003
【总页数】6页(P532-537)
【关键词】固定化;土壤;多环芳烃;细菌;真菌
【作 者】王鑫;苏丹;李海波
【作者单位】沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室,辽宁,沈阳,110044;辽宁省 冰鲜台环境科学研究院∥辽宁省流域污染控制重点实验室,辽宁,沈阳,110031;沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室,辽宁,沈阳,110044
【正文语种】中 文
【中图分类】X592
微生物修复(降解)是环境中多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)去除的最主要途径[1]，应用微生物修复受PAHs污染土壤，高效降解菌的筛选是关键[2]。菌种的优劣影响修复效果和修复时间，国内外有关PAHs降解菌筛选方面的研究很多[3-6]，但多是在水中或泥浆中研究降解菌的降解效果。同一降解菌在不同介质中的降解能力差异很大[7-9]，Ramirez等[10]在研究芘的微生物降解时，发现分支杆菌(Mycobacterium sp.)在泥浆反应器中对芘的降解率低于在水介质中的降解率；Poeton等[11]报道，菲在土壤中的降解率是其在泥浆中降解率的2.1～3.5倍。在水中降解能力高的菌株，在土壤中并不一定具有同样高的降解特性。
固定化微生物技术是20世纪80年代兴起的一种新型生物技术。其优点是可以大幅度提高参
加反应的微生物浓度，反应过程控制较容易，并能保持高效菌种，固定化后的微生物耐环境冲击性增强，可降低二次污染等，因此被广泛用于修复受污染的流体介质（如废水）[12]和半流体介质（如泥浆）[13]环境中。但将固定化微生物用于降解非流体介质（土壤）中有机污染物的研究，国内外尚未见报道。
试验以苯并芘(benzo[a]pyrene, BaP)污染土壤为介质，研究了3株细菌和3株真菌对BaP的降解能力及其降解动态变化，筛选出具有高降解能力与高降解速率的菌株。在此基础上，以蛭石为载体进行混合菌共固定化，探讨最适固定化载体与固定化方法，为其原位应用奠定一定基础。同时研究了固定化混合菌对土壤中BaP的降解特性，为固定化技术在土壤中的应用提供科学依据，对进一步解决环境中PAHs污染问题具有实践意义。铲雪锹
ca17031 材料与方法
1.1 试验材料与菌株
供试土壤采自中国科学院沈阳生态试验站0～20 cm表层清洁土，土壤为草甸棕壤，其基本理化性状：pH为6.8，有机碳为17.8 g·kg-1，全氮为1.1 g·kg-1，全磷为0.35 g·kg-1。土壤风干后过2 mm尼龙筛，备用。
载体蛭石取自本实验室。BaP（均为德国Fluka公司产品,纯度＞97%）；甲醇（山东省禺王实业总公司化工厂，谱纯）；二氯甲烷（沈阳经济技术开发区，分析纯），正己烷（沈阳经济技术开发区，分析纯）。
从石油污染土壤分离、驯化、选育而得的3株细菌和3株真菌，经液体培养证明能够降解PAHs. 3株细菌经鉴定[14-15]分别为芽孢杆菌(Bacillus sp.，SB02)，动胶杆菌(Zoogloea sp.，SB09)，黄杆菌(Flavobacterium sp.，SB10)，3株真菌经鉴定分别为木霉(Trichoderma sp.，SF02)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum，SF04)，毛霉(Mucor sp.，SF06)。试验用细菌密度为6×108 mL-1，试验用真菌菌剂为孢子悬浊液，孢子密度6×108 mL-1。种子斜面培养基：马铃薯0.3%，蔗糖2%，牛肉膏0.2%，琼脂2%，NaCl 0.5%，pH自然。固定化增殖培养基：蔗糖4.0%，酵母膏0.3%，KH2PO4 0.05%，(NH4)2HPO4 0.2%，MgSO4·H2O 0.025%，pH 6.0～6.5。
1.2 实验方法
1.2.1 高效降解菌筛选试验
售检票系统高效降解菌筛选实验：土壤过2 mm筛后，分装培养瓶中，每瓶30 g，121 ℃高温灭菌60 min，冷却后，在无菌条件下移取一定量的BaP丙酮溶液，使其初始质量分数为50 mg·kg-1，放置过夜。按10%量接种菌悬液，通过灭菌棉塞控制通气量，以不加菌液为对照，随时补加无菌水，使土壤水分为30%，置25 ℃恒温箱(DHP-500BS, 中国)中避光培养，分别在0、7、14、21、28、35、42 d取样测定土壤中BaP的残留量，每种处理3个平行，重复2次。
船舶智能焊接技术
1.2.2 固定化混合菌的制备
蛭石载体的改性处理：加入1 mol·L-1 HCl，固液比1∶20，83 ℃恒温水浴搅动2 h，蒸馏水冲洗，烘干，再于500 ℃焙烧6 h，得到酸处理并焙烧蛭石（LV500）。改性后蛭石（LV500）121 ℃高温灭菌60 min，按10%量接游离混合菌，真菌6×108 g-1，细菌1×105 g-1，25 ℃恒温培养，每24 h补加一次增殖培养液，连续补加3次。培养过程中，随着混合菌的生长，部分微生物自然固定在载体上，培养结束后用去离子水洗涤固定化混合菌细胞数次，便制得固定化混合菌，以不接混合菌的空白载体为对照，通过两者质量差计算蛭石对微生物的吸附量。
1.2.3 固定化混合菌降解实验
筋膜仪
土壤过2 mm筛后，分装培养瓶中，每瓶30 g， 121 ℃高温灭菌60 min，冷却后，在无菌条件下移取一定量的 BaP丙酮溶液，初始质量分数均为50 mg·kg-1，放置过夜。按 2%量接种固定化混合菌，以游离菌为对照。置 25 ℃恒温箱中避光培养，随时补加无菌水，使土壤水分为30%，分别在0、7、14、21、28、35、42 d取样测定土壤中BaP残留量，每种处理3个平行，试验重复2次。
1.2.4 土壤BaP的测定
取培养瓶中土样，过1mm筛后放于25 mL离心管中，加入20 ml二氯甲烷提取液于超声水浴中超声提取2 h，温度控制在40 ℃以下。将提取液离心分离，硅胶柱净化处理，收集的洗脱液转移到K.D.浓缩器中，氮气吹干后用甲醇定容至1 mL，高效液相谱(HPLC)测定。
谱操作条件：惠普 1090-Ⅱ液相谱仪（Hewlett-Packard 1090-II, New York, USA，配有自动进样器），二极管阵列检测器(Diode Array Detector，DAD)，C18烷基硅胶反相谱柱，流动相为甲醇(使用前过 0.45 µ的玻璃纤维膜)，流速0.800 µL·min-1，柱温(40±0.1)
℃，进样量10 µL，检测波长：BaP 290 nm，实验以BaP标准液为外标，用保留时间法直接对照计算BaP的含量[16]。
微生物对BaP的降解率公式为：
微生物对BaP的降解速率公式为：
式中，η为降解率(%)，Ct为剩余PAHs的质量分数(mg·kg-1)，Ct为对照中剩余PAHs的的质量分数(mg·kg-1)，C0为初始PAHs质量分数(mg·kg-1)，µ为降解速率(mg·L-1·d-1)，∆T为取样时间间隔(d)。
1.2.5 BaP测定方法回收率试验
称取1.000 g土壤置于10 mL离心管中，加入配制好的BaP丙酮溶液，同时进行本底空白试验，重复4次。将上述样品于暗处放置，待有机溶剂挥发至干后进行样品的提取，BaP的回收率按 1.2.4中的方法测定，测得BaP的回收率(89.42%±3.03%)。通过对灭菌土壤中BaP的质量分数变化可知BaP在土壤中不易挥发和水解。
1.2.6 固定化微生物微观结构观察
将空白载体与固定化微生物同时进行增殖处理，2.5%戊二醛固定3 h，用磷酸缓冲液清洗3次，每次清洗3 min，用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇脱水3次，每次15 min，二氧化碳临界点干燥60 min以上，粘台后喷金15 min，采用JSM-300扫描电子显微镜(SEM)观察载体与固定化微生物微观结构。
2 结果与讨论
2.1 微生物对BaP降解
由图1可见，3株细菌对土壤中的BaP均有一定的降解能力，但降解率存在显著差异。SB02对BaP的降解能力最强，42 d内可以降解33.0%；SB09和SB10对BaP的降解能力相对较弱，42 d降解率分别为25.4%和22.0%。
图1 42 d内细菌对土壤中BaP的降解率Fig. 1 Degradation rate of BaP in soils by bacteria in 42 days
由图2可见，3株真菌对BaP均有一定的降解能力，SF04对BaP的降解能力最强，42 d降解率71.3%；SF02和SF06对BaP的降解率没有显著差异，其降解率标准偏差为±2.1%。
