袁国文1，沈海波1，方剑儒2，*，张连钢1
（1.甘肃省嘉峪关市食品药品和医疗器械检验检测中心，嘉峪关 735100；
2.张掖市药品检验检测中心，张掖 734000）
摘要：采用液-液萃取方法对油脂样品进行前处理，对文献［1］中苯并［a］芘检测方法不确定度来源的分析与评定，研究实验过程中每一步定量操作对实验结果偏差的贡献值。规范实验操作中的不规范之处，减小油脂中苯并［a］芘检测实验过程的各个不确定度分量，提高日常检测结果的准确性和可靠性。现以阳性菜籽油样品中苯并［a］芘残留量测定为例，建立数学模型，从试样称量、量器的使用、标准工作液的配制、重复性测量等各个分量进行评定。在本次实验中，其中苯并［a］芘含量为24.54ng/g，待测液中苯并［a］芘浓度为4.908ng/mL，其扩展标准不确定度为2.7ng/g，对苯并［a］芘残留量测量不确定度有显著贡献的有三个方面：多次平行试验过程中重复测量产生的A类测量不确定度，uArel=0.02748；配制标准系列过程产生的B类测量不确定度，主要影响测量不确定度的步骤为使用1.0mL刻度吸管分别吸取1.0、0.75、0.5、0.25mL，主要原因是由于吸取较小体积溶液时，刻度吸管精 度不够所导致，u标准配制rel=0.03973；线性拟合过程产生的测量不确定度。相比之下，定容和称量步骤引起的测量不确定度可以忽略不计。
关键词：液-液萃取；液相谱法；苯并［a］芘；数学模型；测量不确定度评定
中图分类号：O652.62/O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2021）01-0072-09
doi：10.19804/j.issn1006-2513.2021.01.012
Evaluation of measurement uncertainty for determination of
benzo ［a］ pyrene in oil by liquid chromatography with liquid-
liquid extraction pretreatment
YUAN Guo-wen1，SHENG Hai-bo1，FANG Jian-ru2，*，ZHANG Lian-gang1
（1 Jiayuguan city，Gansu Province Food Medicine and Medical Equipment Inspection and Testing Center，Jiayuguan 735100；2. Zhangye Pharmaceutical Inspection and Testing Center 734000）
Abstract：The oil was pretreated by liquid-liquid extraction，and the uncertainty of benzo ［a］ pyre
ne detection from the reference ［1］ was analyzed and evaluated. The contribution of quantitative operation in each step to the deviation of experimental results was studied. Non-standard operation reduced the uncertainty components and improved the accuracy and reliability of test results. Determination of benzo ［a］ pyrene in the positive rapeseed oil was used as
收稿日期：2020-09-24
作者简介：袁国文（1965-），男，医学士，副主任药师，研究方向：主要从事食品药品分析检测工作。
*通讯作者：方剑儒（1988-），女，本科，主管药师，研究方向：主要从事食品药品分析检测工作。
the example，a mathematical model was established to evaluate sample weighting procedure，the measuring device usage，standard working solution preparation and repetitive measurement. In this experiment，the content of benzo ［a］ pyrene was 24.54ng/g，the concentration of benzo ［a］ pyrene in solution was 4.908ng/mL，and the extended standard uncertainty was 2.7ng/g. There were three significant contributions to the measurement uncertainty：class
A measurement uncertainty caused by repetitive measurements in multiple parallel tests，uArel =0.02748；class
B measurement uncertainty generated in the preparation of standard solution series，the main step affecting the measurement uncertainty was using 1.0mL pipette to absorb 1.0，0.75，0.5，0.25mL，respectively. The main reason is that the precision of pipette is not enough measuring smaller volume solution；and the measurement uncertainty generated by linear fit process. In contrast，the measurement uncertainty caused by volume adjustment and weighing steps can be ignored.
Key words：liquid-liquid extraction；liquid chromatography；benzo ［a］ pyrene；mathematical model；evaluation of measurement uncertainty
1 前言
测量不确定度（uncertainty of measurement）：表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。测量不确定度用于衡量测量结果的质量。是测量结果可疑程度的一种定量表述，是实验室提高检验结果可靠性的重要保障［1，2，3］。对不确定度进行有效分析和评定，可以出造成实验结果误差的原因，减少不确定度可以有效提高测定结果的准确度，是质量控制的一个重要手段［4］。测量不确定度由多个分量组成。其中的一些分量可用测量结果的统计分布估算，并用实验标准偏差表征。另一些分量可用基于经验或其他信息的假定概率分布估算，也可用标准偏差表征。测量不确定度是“说明了置信水准的区间的半宽度”。
也就是说，测量不确定度需要用两个数来表示：一个是测量不确定度的大小，即置信区间；另一个是置信水准（或称置信概率），表明测量结果落在该区间有多大把握［5］。
苯并［a］芘（Benzoapyrene），化学式：C20H12，英文表示BaP，是一种五环多环芳香烃类。结晶为黄固体。这种物质是在300到600℃之间的不完全燃烧状态下产生。苯并芘存在于煤焦油中，而煤焦油可见于汽车废气（尤其是柴油引擎）、烟草与木材燃烧产生的烟，以及炭烤食物中。苯并芘为一种突变原和致癌物质，从18世纪以来，便发现与许多癌症有关。其在体内的代谢物二羟环氧苯并芘，产生致癌性的物
质。BaP被认为是高活性致癌剂，但并非直接致癌物，必须经细胞微粒体中的混合功能氧化酶激活才具有致癌性。由于苯并［a］芘是第一个被发现的环境化学致癌物，而且致癌性很强，故常以苯并［a］芘作为多环芳的代表，它占全部致癌性多环芳烃1%～20%。食用油中的苯并芘主要有以下来源：
（1）目前食用油脂中的污染物主要为农药和多环芳香烃（PAHs）。油料作物在生长过程中，从土壤和水中吸收的多环芳香烃（PAHs）最终会转移到油脂产品中；
（2）在油脂的加工过程中，有机溶剂的使用也会增加产品中多环芳香烃（PAHs）的含量；
（3）由于油料种子的迁移作用以及不当的油脂加工条件，使之可能存在于食用油中。特别是一些增香油脂（如浓香花生油和芝麻香油）的生产过程，往往需要对油料进行高温焙炒以产生浓郁的香味，但若焙炒温度过高或产生局部焦糊现象，很可能因有机物的热解和不完全燃烧而产PAHs。
也有研究表明，当油料油脂被炒焦或炭化时，PAHs 含量会显著增加。对苯并［a］芘在食用油脂中的最大残留量做了明确规定［10］，最大残留限值的是10μg/kg。
本实验根据《JJF 1059.1-2012 测量不确定度评定与表示》［11］和《JJF 1135-2005 化学分析测量不确定度评定》规定的方法［12］，以文献［1］为检测方法，建立数学模型，分析油脂中苯并［a］芘检测不确定度分量，对其测量的不确定度
予以评定［14-17］。
2 材料与方法
2.1 主要仪器
岛津20A液相谱仪，U=0.3%，k=2；分析天平XS225A-SCS，精细量程0～225g，最小刻度值0.0001g，0～50g示值最大允差为±0.0001g；A级刻度吸管，1mL，允差为±0.008mL；A级单标吸管，1mL，允差为±0.007mL；A级刻度吸管，5mL，允差为±0.025mL；A级容量瓶，100mL，允差为
±0.1mL；A级容量瓶，10mL，允差为±0.02mL。
2.2 试剂和试样
苯并［a］芘标准品10.0ug/mL，购自中国计量科学研究院，U=0.1，k=2；乙腈（CH3CN）谱纯，北京百灵威科技有限公司；正己烷（C6H14）谱纯，北京百灵威科技有限公司；四氢呋喃（C4H8O）谱纯，北京百灵威科技有限公司；超纯水。
油脂样品，兰州市城关区雁滩粮油市场。2.3 方法
2.3.1 苯并［a］芘标准使用液配制
将苯并［a］芘标准品从冰箱中取出放置至室温，准确吸取标准品1.00mL，至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，摇匀，得到100ng/mL 苯并［a］芘标准中间液。分别准确吸取100ng/mL 苯并［a］芘标准储备液1.00mL、0.75mL、0.50mL、0.25mL、0.00mL至五个10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，摇匀，得到10ng/mL、7.5ng/mL、5.0ng/mL、2.5ng/mL、0.0ng/mL苯并［a］芘标准使用液。
2.3.2 油脂样品处理过程
称取阳性（其苯并芘含量为24.54ng/g，待测液中苯并芘浓度为4.908ng/mL）样品1.0000g （精确至0.
0001g），置于15mL离心管中，加提取液5.00mL提取，离心，取下层清液用0.22μm滤膜将样液过滤到样品瓶中，待测。
2.3.3 谱条件
a）谱柱：碳十八谱柱4.6×250mm分析柱；
b）流动相：水+乙腈；
c）流速：1mL/min；
d）柱温：30℃；
e）进样量：20μL；
f）激发波长：384nm，发射波长406nm。
3 结果与讨论
3.1 数学模型
试样中苯并芘含量计算公式如下：
M
称样样质
×1000
X=（
C
样品
-C空白）×V定容体积×1000
式中：X——样品中苯并［a］芘的浓度，单位为微克每千克（μg/kg）；
C样品——样品待测液中苯并［a］芘浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
C空白——空白待测液中苯并［a］芘浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V定容体积——试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
M称样质量——试样称样质量，单位为克（g）。
3.2 标准不确定度来源
3.2.1 试样溶液定容体积（V定容体积）引起的测量不确定度分析
由图1可知，其中溶剂挥发，读数随机误差，操作随机误差等因素在A类测量不确定度（重复性引起的测量不确定度）中考虑。该实验定容体积为5.00mL，使用5mL刻度吸管吸取液体至“0”刻线，为一次定量读数，放出液体5.00mL 为第二次定量读数，所以定容体积数学模型为V定容体积=V放出液体读数-V吸取液体读数。且uV放出液体读数= u V吸取液体读数，此时，单次测量不确定度可以考虑由溶剂对温度的膨胀系数和量器最大允差所引起。
3.2.2 试样称样质量（M称样质量）引起的测量不确定度分析
有图2可知，其中人员随机误差，操作随机误差等因素在A类测量不确定度中考虑。该实验为直接称量法，称样量为1.0000g，使用0.0001g，0～50g示值误差为±0.0001g分析天平；所以称量样品数学模型为M称样质量=M最终读数-M归零读数。且u M最终读数=u M归零读数，此时，单次测量不确定度可以考虑由量器最大允差所引起。
能源智能控制
量器本身误差
操作人
操作
溶剂膨胀系数
量器最大允差
刻度吸管读数数学模型为V=V 最终读数-V 0
图
1 定容引起的不确定度不同因素及其影响
Figure 1 Causal diagram of different factors of uncertainty caused by constant volume and their influences
称量方法操作人员天平最大允差
桥壳操作随机误差
称样质量数学模型为M=M 最终读数-M 归零读数
图2 样品称量引起的不确定度不同因素及其影响
Figure 2 Causal diagram of different factors of uncertainty caused by sample weighing and their influences
3.2.3 样品待测液中苯并［a ］芘浓度（C 样品）和（C 空白）引起的测量不确定度分析mrxj
由图3可知，其中人员随机性误差，操作随机误差等因素在A 类测量不确定度中考虑。该实
验使用U =0.3%，
k =2的液相谱仪，且u C 样品= u C 空白，此时，单次测量不确定度可以考虑由量器最大允差和标准曲线拟合所引起。
标准曲线拟合
操作人员
仪器设备测量不确定度
操作随机误差
待测液中目标物浓度
图3 检测待测液浓度的不确定度不同因素及其影响
Figure 3 Causal diagram of different factors of uncertainty in detecting the concentration of the
tested solution and their influences
3.2.4 标准溶液配制引起的测量不确定度分析肽链合成
由图4可知，其中人员随机性误差，操作随机误差等因素在A类测量不确定度（重复性引起的测量不确定度）中考虑。该实验使用U=0.1，k=2的液体标准品，没有称量过程，采用逐级稀释方法。考虑由溶剂对温度的膨胀系数和量器最大允差所引起的测量不确定度。综上，该实验测量不确定度由以下因素引起：
a称取样品质量产生的不确定度u Mrel；
b定容引起的不确定度u Vrel；
c标准使用液配制的不确定度分量u标准配制rel；
d由液相谱仪检测样品中苯并芘含量产生的不确定度u crel；
e有重复性引起的测量不确定度u重复rel。
配制方法操作人员
操作随机误差
称量游梁式抽油机
标准溶液
图4 检测待测液浓度的不确定度不同因素及其影响
Figure 4 Causal diagram of different factors of uncertainty in detecting the concentration of the
tested solution and their influences
3.3 不确定度的计算
3.3.1 在重复性条件下，对三份阴性油脂样品进
行三种浓度水平加标实验，由三位不同实验人员
分别完成。测量数据如表1：
表1 测量结果
Table 1 Measurement result
序号
人员A检测值
（ng/g）
标准偏差
S（ng/g）
人员B检测值
（ng/g）
标准偏差
S（ng/g）
人员C检测值
去污剂（ng/g）
标准偏差
S（ ng/g）加标5.0ng/g
4.95
0.1497
4.55
0.1984
4.05
0.1639
4.86 4.56 4.13
4.65 4.13 4.28
4.82 4.63 4.46
4.59 4.42 4.12
加标15.0ng/g
14.69
0.2424
13.96
0.1339
14.22
0.2314
14.5814.2014.36
14.4314.1614.07
14.1513.8814.18
14.7614.0614.67
加标25.0ng/g
23.98
0.2842
24.62
0.3556
24.11
0.2232
24.1024.1324.65
23.8924.8124.35
24.4724.1424.61
24.5124.8624.54
