材料和方法
(Materials and Methods )
健康7日龄Wistar乳鼠20只，清洁级，雌雄不限，体重1.3±2.7g；孕15～17d 清洁级成熟Wistar雌性大鼠12只，体重350～450g，随机分两组，实验干预后，生产仔鼠纳入实验，动物由新疆地方病研究所动物中心提供(许可证号:SCXK(新2003-0002)。饲养条件为室温(23±2)℃，光照控制12 h(7:00am～7:00pm)，自由饮食水。置于安静、温暖、避强光的环境中分笼饲养，购买大鼠后先饲养一周，使其适应新环境。 实验分三组：脂多糖缺氧组(LPS)14只；颈动脉结扎缺氧组（HIE）13只；生理盐水对照组（NS）12只；本实验研究符合动物保护委员会标准要求，实验中尽可能减少使用动物的数量和减轻动物的痛苦。
2．实验仪器和设备
实验仪器和设备（见图1-4）
旋转工作台名称 生产厂家
国产手术显微镜 中国镇江中天公司
动物缺氧箱 上海市儿科医学研究所
X/11型智能氧量分析仪 上海昶艾电子科技公司
自动脱水机(MICROM STP120) 德国 Leica 公司物联网监控平台
自动染机 德国 Leica 公司家庭水循环
自动包埋机 Leica EG 1150H 德国 Leica 公司
切片机 Leica RM 2235 德国 Leica 公司
冷台 Leica 1150C 德国 Leica 公司
光学显微镜 日本 Nikon
数字信号采集分析系统 德国 Zeiss
脂多糖(LPS)血清型055:B5
盐酸储存罐
平衡木实验装置 美国Sigma公司 自制
Morris水迷宫装置 自制
足印分析装置 自制
3．实验方法及评价鉴定
3.1 模型制作方法：
3.1.1脂多糖缺氧组：受孕15-17d Wistar孕鼠腹腔注射脂多糖（LPS），注射剂量
0.4mg/kg.d，12h后置于恒温密闭缺氧箱中缺氧2-2.5h，复苏4h后在腹腔注射同剂量LPS，然后放入笼中饲养，孕鼠自体分娩，生下乳鼠同笼饲养，饲养至4-6周后进行实验检测个实验指标。见图9-14. 3.1.2 颈动脉结扎缺氧组：按照Adem Aydina[18]方法，首先对出生7天Wistar乳鼠异氟醚吸入麻醉后，仰卧手术平台上固定，用75％乙醇颈部皮肤消毒，在手术显微镜下行颈正中左旁纵切口，长约0.6㎝，仔细分离皮下及浅筋膜，会看到颈动脉三角，在其三角内到颈总动脉，动脉粗大、波动明显，证明其准确无误，然后，仔细分离与颈总动脉密切伴行的迷走神经后，以6－0丝线双重结扎颈总动脉两端，并从中离断，检查无明显出
血后缝合切口。手术完成后麻醉恢复2小时，然后在放入混合气体（8%O
2+92%N
2
）恒温密
闭缺氧箱中缺氧2h，取出后继续保温1h，送回母鼠笼中饲养，饲养至4周后进行实验观察和检测。见图5-9.
3.1.3生理盐水对照组：孕15-17d Wistar大鼠给予同剂量的生理盐水（注射剂量按0.4mg/kg.d）腹腔注射，连续两天腹腔注射后，放回笼中饲养，孕鼠自体分娩，生下乳鼠同笼饲养，饲养4-6周后实验观察。
3.2 动物模型评价方法
3.2.1平衡木实验：平衡木实验室是让动物穿过粗细不均并抬高的横柱，进入一密封的平台，这种方法是测定动物的运动协调性和平衡能力，通过计算动物后足脱落的次数及其穿过的横柱的时间，即潜伏期（通常前爪较后爪较少脱落）。按照吴俊芳[19] 等方法，对干预后4-6周的大鼠进行平衡木实验。具
体方法如下：①训练阶段，将动物从饲养室移入实验室，适应60分钟，用直径28mm方柱进行训练。将动物置于横柱的起始端，秒表计数其穿越横柱中间80cm距离进入暗盒的时间，即潜伏期。设定最长潜伏期为60秒。每只动物每天训练4次，连续训练3天，每天训练结束后，将动物送回饲养室饲养，以70％乙醇清洗试验装置。②测试阶段，实验动物适应环境60分钟后，分别测试大鼠在不同直径横柱上的潜伏期及左、右后足滑脱次数，在计算时取其平均值，测试完毕后送回饲养室。③实验注意事项：所有测试须保持实验室温度、湿度、光照强度一致；每次实验结束后以70％乙醇清洗试验装置；动物脱落潜伏期不稳定时，需要继续训练2-3d。如图15所示。
3.2．2足印分析实验：是一种简单而又有效的分析动物运动步态的方法，用于大鼠运动缺失的分析，饲养4-6周的大鼠进行足印分析实验。具体方法如下[19]：首先是训练阶段，先将16×42cm白纸铺在实验台上，一端与目标盒相连，在每张纸右上角标动物号码。将动物从饲养室移入实验室适应60分钟，用毛刷在动物前爪、后爪足底分别刷不同颜的彩颜料。立即将动物放置于白纸一端，使其朝着目标盒方向走，计算动物穿过白纸进入目标盒的时间，即为潜伏期，设定最长潜伏期60秒。每天每只动物训练3次，
每次间隔5-10min，连续3天后可进行正式测试。实验通过计算其潜伏期、前、后爪的宽度、重复步态以及大步长度来分析实验结果，测试完毕后送回饲养室，以70％乙醇清洗试验装置。所有测试须保持实验室温度、湿度、光照强度一致。利用大鼠喜暗习性，我们对足印分析装置进行如下改进：在大鼠
拟通过的白纸上方加用一个不透光的三棱柱形隧道，隧道的另一端通暗盒。通过以上处理，大大减少了大鼠进入暗盒前的探索行为，使得大鼠留在白纸上的足印清晰可辨。如图16所示。
电线印字机
3.2.3 Morris水迷宫空间记忆实验：这一实验的基础是利用Wistar大鼠在水中有强烈的逃避水环境的动机，并以最快、最直接的途径逃避水环境。学会逃避水环境的过程体现动物的学习、空间记忆能力；实验动物饲养6周后进行自制Morris水迷宫空间记忆学习实验 [20-21]。①实验设备：水迷宫由直径为150cm，高为50cm圆形水池组成，将水池分为4个象限，水池上方有一摄像机记录游泳轨迹。实验时水温控制在23℃～25℃，将有机玻璃制圆柱型平台(直径8cm，高28cm)随机放入某一象限的中间，水面高于平台1.5～2cm.实验时，在水中加入牛奶或奶粉将水搅浑以免让动物看清水下的平台，摄像机记录动物在水中的位置、游泳距离和时间以及游泳路径。记录大鼠从入水至爬上隐匿性逃逸平台的时间(s)，即逃逸潜伏期；②实验方法：首先将动物头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物到平台的时间(s)。在前几次的训练中，如果这个时间超过60秒，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10秒钟。其次，将动物移出水面，用吹风机或棉布擦干动物身上的水迹，以免水温过低或水中时间过长导致动物死亡。每只动物每天训练4次，每次间隔15-20min，连续5天，训练结束后擦干小鼠放回笼具饲养。最后记录实验数据并分析。在整个水迷宫实验的过程中，每天均保持实验室的光线、环境布局不变及周围环境安静，如图17-18所示。
3.3 HE染病理检查
3.3.1标本的取材固定：干预后饲养6周后行HE染病理学检查。首先大鼠腹腔注射10％水合氯醛800mg/㎏，麻醉生效后固定手术平台上，剪去体毛，肉眼下用手术剪刀剪开皮肤，钝行分离皮下组织，分离左侧肋间肌，暴露左侧胸腔后，用输液针穿刺经左心室－主动脉弓处，开放输液器，先用肝素化生理盐水输注，然后以10％甲醛溶液心脏灌注，要求先快后慢，灌注发现动物头尾四肢僵硬，眼球及肝脏发白，表明灌注成功。灌注目的是通过上述方法将大鼠颅腔内的血液置换出来并固定脑组织，保护其完整性，便于整体取出脑组织。然后，从寰枕关节处断头，延两侧缝隙去除顶骨，暴露脑组织，仔细分离额叶的神经后，取出脑组织后，以 4％多聚甲醛溶液固定，固定24小时后。在鼠脑前囟前后1cm冠状切开，留取标本，如图19-22所示
3.3.2留取标本首先在全自动生物组织脱水机进行脱水，脱水处理后的标本置于浸蜡缸中孵育箱中2小时，要求温度为60℃恒温，并制成2cm×2cm×0.5cm蜡块；
3.3.3其次进行轮转式切片机切片，厚度要求3μｍ，摊片并贴片至载玻片上，置60℃烤箱30分钟烘干备用。
3.3.4 HE染切片制作流程如下：
（1）HE染前，先将切片置入二甲苯中脱去其中的石蜡，共计2次，每次20min；然后入100％、95％、85%的梯度酒精中脱水10～15分钟；在放入苏木精溶液中染，染5分钟后用自来水洗去多
余的染液；
（2）苏木精染后放入盐酸酒精约10秒钟分，一般细胞核着较深，其它结构无时为最佳；然后用自来水缓慢冲洗10min，目的是使苏木精“蓝化”即胞核呈蓝；在行伊红染2分钟（伊红浓度1％），用蒸馏水洗去多余的染液后酒精脱水，最后用二甲苯透明标本2次，每次用时约15分钟左右；在用吸水棉擦去载玻片上多余的二甲苯，在透明后的切片上，滴中性树胶1～2滴，加盖玻片封片，待树胶略干后，贴上标签，干燥环境中保存，标本就可以在镜下观察拍照。
3.4 电镜观察
电镜标本制作：（1）将切取脑室及其周围的脑组织立即置于2％多聚甲醛--2.5%戊二醛中固定2 小时；然后取出用二甲砷酸钠缓冲液（pH7.2）冲洗约10 分钟，共计3 次；在4℃1%锇酸（OsO4）中固定2 h，然后梯度酒精中脱水；（2）然后用环氧丙烷、树脂按照不同比值进行置换，用环氧树脂Epon812 包埋，最后用天青-美蓝染和醋酸双氧铀/枸橼酸铅染；光学显微镜定位；透射电镜观察，拍照，采用数字信号采集分析系统（ZeissE600）对组织切片进行图像采集和分析。
统计学分析
(Statistics)
x±）表示， SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，所有数据采用均数±标准差（s
以P<0.05 为有统计学差异。
结 果
智慧交通管理（Results）
1.平衡木实验结果：与对照组比较，脂多糖缺氧组、颈动脉结扎缺氧组动物在通
过平衡木横杆的时候，神态迟疑不定，探索行为较多，通过横杆时双侧后肢关节活动僵硬，右侧更明显，协调能力差，在通过平衡木潜伏期时间上明显较对照组差（P＜0.05）；
对照组大鼠双侧后肢关节活动自如，协调性好。脂多糖缺氧组与颈动脉结扎缺氧组间在
平衡木潜伏期通过时间上无显著性差异(P>0.05)。
x±）
表1：4周后各组平衡木实验数据表（s
组别 N 后足脱落次数 平衡木通过时间（s） NS对照组： 12 0.00±0.00 3.00±0.34
HIE组： 13 2.76+0.72 9.74±1.82a
LPS组： 14 3.00+0.55 9.61±1.98a
F 121.7 90.361
P 0.01 0.01 注：a：与对照组比较，P＜0.05。
2.足印分析结果：如图：29-31所示：与对照组比较，脂多糖缺氧组、颈动脉结扎
缺氧组大鼠右侧前后肢足印重复性差，表现为间距较大，且间距不稳定；对照组大鼠双
侧前后肢足印重复间距较小，且间距变异较小。统计数据显示：4周后脂多糖缺氧组、
颈动脉结扎缺氧组右侧重复步态间距明显大于对照组，P＜0.01；左侧无明显差异性，P
＞0.05；脂多糖缺氧组与颈动脉结扎缺氧组比较无明显差异性，P＞0.05。如表2所示。
x±）
表2 各组4周足印步态重复间距比较 （s
后足重复间距(cm)
组别 N
左侧 右侧
NS对照组： 12 1.00±0.44 1.05±0.40
HIE组： 13 1.28±0.25 1.43±0.40a
LPS组： 14 1.30±0.56 1.65±0.55a
F 1.79 5.431
P 0.081 0.009 注：a：与对照组比较，P＜0.05。
3.Morris水迷宫实验结果：实验中各组大鼠寻平台的行为差异很大。第一次
训练时各组大鼠先绕池壁快速游动，试图通过池壁逃生，航行没有方向性、目标性。但
是NS对照组经过几次失败的尝试后 ，开始以对角线在水池中航行, 第 1天后就开始有
