7.阴性干扰实验
精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各20μl，注入高效液相谱
8.谱条件的确定与专属性实验
谱柱：HYPERS ODS2。
柱温：25℃。
进样室温度：室温；
进样体积：20μl。
natr-241
记录大黄素的保留时间和峰形，计算分离度，判定是否可以达到良好的分离效果。 表1专属性实验结果
物质名称保留时间（min）分离度
大黄素
大黄酚
藤蔓根茎
大黄酸
9.线性关系的确定
分别精密称取大黄素的对照品溶液0.5，0.25，0.1，0.05，0.025ml，用稀释液定容至10ml的容量瓶之中，取适量摇匀，微孔滤膜过滤，分别进样20微升，以各对照品溶液的浓度（mg/ml）为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制大黄素的标准曲线。将大黄素的回归方程、相关系数、和线性范围列至表2。同时在信噪比（S/N）为10和3时的浓度为定量限和检出限。
表2大黄素的回归方程，相关系数和线性范围
组分回归方程相关系数r线性范围定量限LOQ检出限LOD
蒸煮炉大黄素
10.精密度，重复性和稳定性实验
精密度实验：取浓度为0.01mg/ml的大黄素的对照品溶液，进样20微升，重复实验6次，分别记录峰面积以及保留时间。验证保留时间的稳定以及测试的精密度，并计算相对标准偏差（RDS）。相对标准偏差较小则表明了仪器的精密度良好。精密度试验记录见表3。
表3精密度试验记录
编号峰面积保留时间
1
无尘拖链2
3
4
5
6
平均值
相对标准偏差（RDS）
重复性实验：取牛黄解毒片供试品溶液6份，在上述谱条件下进样20微升，记录峰面积，计算RDS，相对标准偏差小则表明方法的重复性较好。重复性试验记录见表4.
表4重复性试验记录
编号峰面积平均值相对标准偏差（RDS）
1
2
3
4
5
6
稳定性实验：取牛黄解毒片供试品溶液，室温放置0，4，8，12，16，20，24h，在时间点上分别进样20微升，记录大黄素的峰面积，计算RDS，RDS较小说明供试品溶液在24h内的稳定性好。稳定性实验结果记录见表5.
表5稳定性试验表
编号放置时间（h）峰面积保留时间
10
24
38
412
516
620
724混合罐
平均值
相对标准偏差（RDS)
11.加样回收率实验
精密称取6份牛黄解毒片供试品溶液，各0.05g，置于50ml的容量瓶中，精密加入大黄素对照品适量，用稀释液稀释至刻度，摇匀。分别取1微升按上述方法注入谱中，按照上述谱方法进行检测，记录加入量，测得量，计算回收率，平均回收率以及相对标准偏差，记录在表6当中。
表6大黄素回收率实验结果
称样量样品中量加入量测的量回收率平均值
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
12.耐受性实验
取同一牛黄解毒片供试品溶液，制备供试品溶液，进行测定，考察谱柱的耐受性，观察测定的大黄素的RDS，以及峰及基线的分离程度。
13.样品含量测定
取不同批次的牛黄解毒片，制备供试品溶液，每个批次的样品平行进行测试3份，进样20微升，记录峰面积，按照回归方程计算大黄素的含量，结果记录在表7之中。
表7不同批次样品中的大黄素含量的测定结果
批号大黄素含量
四、设计小结
采用高效液相谱法测定牛黄解毒片中的大黄素含量，方法灵敏、简便快速，结果准确，可行。试验
中药特别注意，熟练规范操作高效液相谱仪，养成试验完毕及时清洗谱柱，流动相要用谱纯试剂，最好用新鲜制备的高纯水。使用有机溶剂注意安全，蒸干
