•对试样有适宜的溶解度
•溶剂粘度要小
水的等级
–纯化水
–蒸馏水
–去离子水
因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
纯化水中去除了无机和有机的污染物
溶剂的等级
–HPLC级
–优级纯
–分析纯
都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒
优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂
HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
溶剂的过滤
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂
脱气：
气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积
断头锁 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形
3）检测器中的气泡产生基线波动
脱气的目的
防止由气泡的产生引起的故障
防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的检测不稳定程度
1）示差折射率检测器
*门牌制作使折射率变化
2）UV检测器（200nm以下）
*溶解氧气有吸收
3钢丝绳滑轮）荧光检测器
*溶解氧气有消光作用
脱气的方法
1. 超身波脱气法
2. He清除法
3. 使用氟树脂膜的减压脱气法
梯度洗脱法
梯度洗脱装置：
高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入
低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到谱柱中。
梯度洗脱：
优点：
可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度
梯度洗脱法的注意点
●溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差
●梯度混合的溶剂互溶性要好
●梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
●查看空白实验的数据。
●遵守分析周期。（最初的分析数据不采用）
样 品 处 理
1. 使用流动相溶解样品
-- 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要
-- 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀
选择缓冲液的步骤
1 .确定最佳分离状态时的流动相pH
2 .选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液
（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）
3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收
（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和
柠檬酸的缓冲液）
一些代表性弱酸的pKa
pK1 pK2 pK3
醋酸 4.87
柠檬酸 3.13 4.76 6.40
磷酸 2.16 7.21 12.32
缓冲液的使用
使用前必须过滤
使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:
用纯水冲洗30-60min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min
易受到细菌和霉菌的影响
管线选择
管线选择
不锈钢
Teflon
PEEK (聚醚酮)
尺寸
0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D.
0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D.
0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D.
0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D
管线材料
•不锈钢 (可用于所有连接)
–能承受几千 kg/cm2 压力
–酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时)
•PEEK (可用于所有连接)
–能承受高达 250 kg/cm2压力
–可在整个PH范围(pH 1-14)内使用
–不适用于高溶解性溶剂如氯仿等
•Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管)
–化学惰性大
–能承受 5 kgf/cm2 压力
液相谱容易出问题的部件
吸滤头
材料：不锈钢烧结，孔径10um
故障：堵塞
表现：管路中不断有气泡生成
措施：用5％～20％的稀硝酸，超声波清洗，再用蒸馏水清洗
注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断
单向阀
故障1：宝石球粘附于垫片
表现：泵无法吸液或排液，流路不通
措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开
2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗
故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好
表现：系统压力波动大
措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗
柱塞密封圈
故障：密封圈磨损而导致密封不良
现象：系统压力波动大或
漏夜措施：更换密封圈
注意点：
更换密封圈拆卸泵头前，柱塞杆复位 （P－稻壳发电SET）
线路过滤器
故障：堵塞
现象：系统压力波动大或压力偏高
措施：5％稀硝酸，超声波清洗
判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力>3kgf/cm2，则可能堵塞。
进样器
•自动进样器
•手动进样器
•原理：（六通阀）
• 注入方式：
•清肺排毒颗粒的功效与作用 1）全量注入
• 2）部分注入
手动进样法
•便捷的方法（不需清洗）
• 1.进样状态下插入微量注射器
• 2.切到装填状态
• 3.注入样品
• 4.切回到进样状态
手动进样器
•操作注意点：
•1）插针应插到底
•2）进样应使用液相谱专用平头进样针
•3）清洗应使用专用针口清洗器
手动进样阀
故障：转子密封损坏
现象：漏液
原因：a 拧的太紧
b 样品太脏
c 针头损坏或不使用液相专用针
解决措施：更换转子密封，并在使用
手动进样阀
故障：载样困难
原因：a 定量环堵塞
b 进样器污染
解决措施：清洗或更换定量环、进样器
•分析结果重现性好
•提高柱效
•降低柱压
•保证检测稳定性
柱子
故障：系统高压、峰型变差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留时间的改变
解决措施：清洗
正相柱，正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇
北斗导航认证启动
反相柱，甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.05M稀硫酸
峰产生有肩或分叉的原因
1. 柱子劣化
（进口处产生不均匀的空隙）
2. 样品劣化
（生成氧化物、分解物等）
判断标准
所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化
延长柱寿命方法：
倒冲柱
修补柱头
谱柱的类型及适用范围
