中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（９）：７ １３
ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ．２０１５０９０２
王丹阳１ 杨 雨１ 杨秀梅１ 张富春１ 吴道澄２ 张爱莲１
（１新疆大学生命科学与技术学院 乌鲁木齐 ８３００４６ ２西安交通大学生命科学与技术学院 西安 ７１００４９）
摘要 目的：以Ｔｏｌｌ样受体拮抗物ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同细胞因子ＩＬ １５作为免疫佐剂，通过滴鼻方式免疫ＩＣＲ小鼠，对卵透明带３（ｍｕｒｉｎｅｚｏｎａｐｅｌｌｕｃｉｄａ，ｍＺＰ３）基因疫苗的免疫增强效果进行观察。方法：将ＰｏｌｙＩ：Ｃ和ＩＬ １５单独或协同与用壳聚糖（ｃｈｉｔｏｓａｎ，Ｃｈｉ）包裹的ｍＺＰ３基因疫苗滴鼻免疫ＩＣＲ小鼠，ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清中特异性抗ｍＺＰ３抗体和生殖道黏液、肺洗液中ｓＩｇＡ的水平，ＭＴＴ法检测淋巴细胞增殖，小鼠的平均窝仔数和生育率检测抗生育情况，组织学观察小鼠的卵巢病理切片。结果：ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同ＩＬ １５共同免疫组能够显著提高免疫后小鼠抗ｍＺＰ３抗体的水平，促进淋巴细胞的增殖，平 均窝仔数和生育率显著降低，小鼠的卵巢发育异常。结论：ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同ＩＬ １５能够增强ｍＺＰ３基因疫苗的免疫效果，并在一定程度上降低小鼠生育率。关键词 ＰｏｌｙＩ：Ｃ ＩＬ １５ 基因疫苗 佐剂
中图分类号 Ｒ３９２．１２
收稿日期：２０１５ ０４ １０ 修回日期：２０１５ ０５ ２５
新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题资助项目（ＸＪＤＸ０２０１ ２０１３ ０７） 通讯作者，
：ｘｊｚａｌ＠１６３．ｃｏｍ 哺乳动物卵母细胞周围包裹着一层卵透明带，在受精过程中卵透明带起着非常重要的作用，如今它已
被作为免疫不育疫苗的理想侯选抗原［１ ２］
。基因疫苗
由于安全性较好已在免疫不育疫苗研究领域里被广泛使用
［３］
，但免疫效果不太理想，因此，就需要通过各种
光线路终端
途径和策略来不断提高基因疫苗的免疫效果，而黏膜接种是一种简单有效的免疫不育疫苗的免疫方式
［４］
。
壳聚糖（ｃｈｉｔｏｓａｎ，ｃｈｉ）可以很好地吸附ＤＮＡ，防止ＤＮＡ降解，相容性好，可作为基因疫苗的佐剂，有效促进黏
膜部位的免疫反应［
５］
。ＰｏｌｙＩ：Ｃ（聚肌苷酸胞苷酸）是ＴＬＲ３的配体，ＰｏｌｙＩ：Ｃ与ＴＬＲ３识别后，激发机体先天免疫反应，促进多种效应分子的表达，如趋化因子、炎
性细胞因子等，以此增强机体的免疫反应［６ ７］
。ＩＬ １５
是含有Ｎ 乙酰氨基半乳糖残基的弱酸性糖蛋白，具有多种生物学功能，能促进Ｂ细胞生长，诱导细胞毒Ｔ细
胞（ＣＴＬ）的生成，刺激ＮＫ细胞的活化与增殖［８ ９］。Ｔｏｌｌ
样受体（ＴＬＲ）是一种模式识别受体，Ｔｏｌｌ样受体能结
合机体自身产生的一些内源性分子，在增强免疫效应
方面发挥重要作用［
１０］
。 本文在前期以ＩＬ １５作为ｍＺＰ３基因疫苗佐剂研究的基础上，发现免疫增强效果和抗生育效果不太理想，所以，本研究选用ＰｏｌｙＩ：Ｃ与ＩＬ １５共同作为基因疫苗的佐剂，先用溶血卵磷脂（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＬＰＣ）进行预处理，用壳聚糖包裹基因疫苗，黏膜免疫小鼠，观察ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同ＩＬ １５共免疫ｍＺＰ３基因疫苗的免疫增强效果。
１ 材料与方法
１．１ 材 料
ＩＣＲ小鼠（２０ｇ左右，雌性，６～８周龄）购自新疆医科大学实验动物中心；
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１和Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）菌株为本实验室保存；实验中的基因疫苗和重组质粒均由本实验室构建；蛋白质分子质量标准购自华美生物技术有限公司，辣根过氧化物标记的羊抗鼠二抗购自Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ公司；ＢＣＡ蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Ｃｈｉｔｏｓａｎ购自山东奥康生物科技有限公司；ＰｏｌｙＩ：Ｃ为杭州美亚药业有限公司产品，限制性内切核酸酶均为Ｔ
ａＫａＲａ公司产品。
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．３５Ｎｏ．９２０１５
１．２ 方 法
１．２．１ ｍＺＰ３抗原的制备 参照文献制备抗原［１１］
，将鉴
定正确的ｐＧＥＸ ４Ｔ ｍＺＰ３进行原核表达，蛋白质诱导表达的条件为：３７℃振荡培养３ｈ，０．８ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导表达４ｈ后，离心收集细菌沉淀，ＰＢＳ洗涤两遍后，细菌沉淀经过变性、复性等处理后得到了融合蛋白，再进行定量。１．２．２ 壳聚糖包裹基因疫苗的方法 ｍＺＰ３重组质粒经小量提取，酶切鉴定后，大量制备，经ＰＥＧ８０００纯化后溶于９
ｇ／Ｌ生理盐水中，定量用于壳聚糖 质粒复合物的制备。根据文献制备壳聚糖包裹的基因疫苗
［１１］
。
１．２．３ 实验动物的免疫 所有的实验动物雌性ＩＣＲ小鼠被随机分为７组，每组６只。Ａ组：９ｇ／ＬＮａＣｌ；Ｂ组：Ｃｈｉ ｐｃＤＮＡ３；Ｃ组：Ｃｈｉ ＰｏｌｙＩ：Ｃ；Ｄ组：Ｃｈｉ ｐｃＤ ＩＬ １５；Ｅ组：Ｃｈｉ ｐｃＤ ｍＺＰ３；Ｆ组：Ｃｈｉ （ｐＣＤ ｍＺＰ３＋ＩＬ １５）。以上６组均作为对照组。Ｇ组：Ｃｈｉ （ｐｃＤ ｍＺＰ３＋ＩＬ １５＋ＰｏｌｙＩ：Ｃ１０μｇ）的小鼠作为实验组；每次免疫前１ｈ用１ｇ／ＬＬＰＣ进行预处理，用壳聚糖包裹基因和佐剂后立即用于动物免疫。于第０天、第７天、第１４天、第２１天进行４次滴鼻免疫。
每次免疫前收集小鼠血清，用直径为１ｍｍ左右灭菌的毛细玻璃针在小鼠眼底采血，收集约２００μ
ｌ血样至无菌微量离心管中。３７℃温育１ｈ，再置于４℃冰箱放置１ｈ。之后，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清液，－８０℃保存备用。 生殖道洗液是在每次免疫前，用ＰＢＳ反复冲洗小鼠的生殖道至少６次得到的；肺洗液是在初免后第４２天，麻醉致死小鼠，取小鼠的肺浸泡于１．０ｍｌ生理盐水中收集上清液得到的；将以上得到的生殖道洗液和肺洗液离心后收集上清液立即做抗体检测。
１．２．４ ＥＬＩＳＡ法检测小鼠免疫后抗体水平 用间接ＥＬＩＳＡ法检测免疫后２８天、４２天、５６天、７０天的小鼠血清、生殖道黏液和肺洗液中的ＩｇＧ和ｓＩｇＡ抗体水平。首先配制浓度为１μｇ／ｍｌ的ｍＺＰ３蛋白包被液，每孔１００μｌ铺在９６孔板中，每孔１００μｌ，３７℃放置１ｈ后置于４℃冰箱１２ｈ。ＰＢＳＴ洗涤３次后，每孔加入１００μｌ５０ｇ／Ｌ脱脂奶粉３７℃封闭１ｈ。ＰＢＳＴ洗涤３次，加入一抗：各组免疫后小鼠的血清和黏液，一抗与稀释液比为１∶１００，每孔１００μｌ，３７℃１ｈ。ＰＢＳＴ洗涤３次，再加入二抗：１∶８０００ＨＲＰ标记的兔抗鼠ＩｇＧ和ｓＩｇＡ，每孔１００μｌ，３７℃１ｈ。ＰＢＳＴ洗涤４次，加入四甲基联苯胺（ＴＭＢ）避光显１５ｍｉｎ，每孔加入５０μｌ２ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４终止反应，设置酶标仪波长为ＯＤ４５０／６５５
的条件下测定光吸收值。１．２．５ ＭＴＴ法检测小鼠免疫后Ｔ淋巴细胞的增殖 首
先分离出最后一次免疫７天小鼠的脾脏，用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ １６４０培养基将其制成单细胞悬液，计数并将细
胞调整为３×１０６
个／ｍｌ铺到９６孔细胞培养板，加入不同
浓度的ＣｏｎＡ、ＢＳＡ、ｍＺＰ３进行刺激，同时设置空细胞对照和空血清对照，放入３７℃细胞培养箱中培养４８ｈ后，每孔加入２０μｌＭＴＴ，３７℃孵育４ｈ，每孔加入１００μｌＤＭＳＯ溶解，设置酶标仪波长为ＯＤ５７０／６３０的条件下测定光吸收值，计算免疫后各组小鼠的刺激指数（ＳＩ）。
１．２．６ 小鼠的抗生育实验和卵巢的组织学检测 小鼠于最后一次免疫后的第７天，
把年龄相当的具有生育能力的雄鼠与雌鼠进行配对，雌鼠出现阴道栓即为交配成功。１～２周后，将雄鼠取出单独喂养雌鼠，观察雌鼠的生育情况。待雌鼠产仔后，记下每组雌鼠的产
仔数并与对照组比较，进行统计分析［１２］
。取与雄鼠配
对后雌鼠的卵巢，放在Ｂｏｕｉｎ’ｓ固定液中固定２４ｈ，进行石蜡包埋、切片等处理，然后用苏木素 伊红进行染，并在光学显微镜下观察卵巢组织的差别。１．２．７ 统计学分析 实验数据均用珋ｘ±ＳＤ表示，采用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５软件进行数据分析，实验数据进行单因素的方差分析，用Ｔｕｒｋｅｙ法进行多重比较，Ｐ＜０．０５为差异具有统计学意义。
２ 结 果
供应链金融管理２．１ 基因疫苗的鉴定
ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３ ＩＬ １５、ｐｃＤＮＡ３ ｍＺＰ３经过碱裂解法小量提取，通过测序及酶切鉴定证明质粒正确，酶切鉴定结果见图１。随后对这三种质粒进行大量制备，酶切鉴定正确后，再经ＰＥＧ８０００纯化、
电泳及定量。
图１ ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤ ｍＺＰ３、ｐｃＤＮＡ３－ＩＬ １５
的酶切鉴定图
Ｆｉｇ．１ ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｃＤＮＡ３、
ｐｃＤ ｍＺＰ３、ｐｃＤＮＡ３ ＩＬ １５
Ｍ：１５０００；１～２：ｐｃＤＮＡ３ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＨｉｎｄＩＩＩａｎｄＸｂａＩ；
磁性刀架３：ｐｃＤＮＡ３ ＩＬ １５ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＨｉｎｄＩＩＩａｎｄＸｂａＩ；４～６：ｃＤ ｍＺＰ３ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＨｉｎｄＩＩＩａｎｄＸｂａＩ
链路层劫持
８
２０１５，３５（９）
王丹阳等：ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同ＩＬ １５作为小鼠卵透明带３基因疫苗佐剂黏膜免疫效果的观察
２．２ ｍＺＰ３抗原的制备及纯化
用ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ进行双酶切ｐＧＥＸ ４Ｔ １／ｍＺＰ３，鉴定正确后［图２（ａ）］，进行ｍＺＰ３蛋白大量制备，电泳结果［图２（ｂ）］说明：ｍＺＰ３基因能够在细菌中大量表
达。收获细菌沉淀后，超声波破菌，ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳检测，ｍＺＰ３蛋白在细菌沉淀中［图２（ｃ）］，该蛋白质主要
以包涵体的方式存在。
图２ 原核表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ １／ｍＺＰ３的鉴定、蛋白质表达及纯化Ｆｉｇ．２ ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＧＥＸ ４Ｔ １／ｍＺＰ３，ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
（ａ）ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＧＥＸ ４Ｔ １／ｍＺＰ３ １：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２，３：ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＧＥＸ ４Ｔ １；４：ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＧＥＸ ４Ｔ １／ｍＺＰ３ （ｂ）ＳＤＳ ＰＡＧＥｏｆａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １，２：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＧＥＸ ４Ｔ １／ｍＺＰ３ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧ；３：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＧＥＸ ４Ｔ １／ｍＺＰ３ｎｏｔｉｎｄｕｃｅｄ；４：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ （ｃ）１～５：ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｌｕｔｉｏｎｓｏｆｍＺＰ３ｐｒｏｔｅｉｎａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｅｄ；６：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ．Ａｒｒｏｗｐｏｉｎｔｔｏｔｈｅｔａｒｇｅｔｂａｎｄ
２．３ 免疫小鼠血清ＩｇＧ和生殖道黏液、肺脏洗液中
ｓＩｇＡ抗体的检测玩具滑翔机制作
为了检测免疫后小鼠体液免疫水平，对免疫后收集的小鼠血清进行检测。ＥＬＩＳＡ检测结果表明：用ＩＬ １５和ＰｏｌｙＩ：Ｃ作为佐剂共免疫可以显著增强ｍＺＰ３基因疫苗的ＩｇＧ抗体水平，
且随着免疫后天数的增加，小鼠血清中的ＩｇＧ抗体水平也逐渐增加，ＩＬ １５和ＰｏｌｙＩ：Ｃ共免疫组Ｃｈｉ （ｐｃＤ ｍＺＰ３＋ＩＬ １５＋ＰｏｌｙＩ：Ｃ１０μｇ）的抗体水平与其他各组相比差异极显著（Ｐ＜０．０１），结果见图３（ａ）。在初次免疫后２８天，４２天收集生殖道洗液和４２天收集肺脏洗液，检测黏膜部位抗原特异性的ｓＩｇＡ的水平。结果表明，小鼠生殖道黏液中ｓＩｇＡ水平比较低，通过统计学分析比较，各组之间没有统计学差异。在小鼠的肺洗液中检测到了一定水平的ｓＩｇＡ、ＩＬ １５和ＰｏｌｙＩ：Ｃ共同免疫组Ｃｈｉ （ｐｃＤ ｍＺＰ３＋ＩＬ １５＋ＰｏｌｙＩ：Ｃ１０μｇ）与其他各组相比差异显著（Ｐ＜０．０５），结果见图３（ｂ）。
２．４ 免疫后小鼠淋巴细胞增殖的检测
为了检测免疫后小鼠细胞免疫水平，对免疫后小鼠进行ＭＴＴ检测淋巴细胞增殖实验，ＣｏｎＡ作为阳性对照，
ＢＳＡ作为阴性对照，ＭＴＴ实验经统计分析，ＩＬ １５和ＰｏｌｙＩ：Ｃ（１０μｇ）共免疫组与其他各组相比差异显著（Ｐ＜０．０１）结果见图４，结果表明ＰｏｌｙＩ：Ｃ（１０μｇ）能够协同ＩＬ １５显著增强ｍＺＰ３基因疫苗的淋巴细胞增殖。
２．５ 各组小鼠的卵巢组织学检测
为了观察小鼠免疫后卵巢发育情况，最后一次免疫后６
周，对各组小鼠卵巢切片进行ＨＥ染，光镜观察显示，Ｅ、Ｆ、Ｇ组与对照组相比小鼠出现异常的卵巢发育，其他各组（Ａ～Ｄ）小鼠卵巢发育正常，如图５所示。２．６ ｍＺＰ３ＤＮＡ疫苗的抗生育效果
小鼠抗生育实验结果显示，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ组小鼠的平均幼崽数和生育率明显降低，与９ｇ／ＬＮａＣｌ对照组达到了差异极显著的水平（Ｐ＜０．０１）（表１）。
３ 讨 论
免疫不育技术是降低人口和有害动物数量的重要手段，随着社会的发展越来越受到人们的关注。ＴＬＲ是近年来发现的重要免疫受体，它通过识别病原体，启动细胞内信号转导通路，激活先天性免疫和获得性免
疫［１０］
。本实验选用的是ＰｏｌｙＩ：Ｃ，它是ＴＬＲ３的激活物，
可以激活获得性免疫反应，进而增强获得性免疫反
应［１３］。然而，由于本实验中基因疫苗免疫原性较弱，不
能够激发强效的黏膜免疫反应。相关文献报道，一些细胞因子和Ｔｏｌｌ受体拮抗物可作为免疫佐剂增强基因
疫苗的黏膜免疫效果［
１４］
，但是，不同的剂量也会产生不同的免疫效果［１５］
，本研究选用ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同细胞因子
ＩＬ １５共同作为黏膜免疫的佐剂，ＩＬ １５的选用和ＰｏｌｙＩ：Ｃ１０μ
ｇ的剂量是在前期研究的基础上进行筛选９
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．３５Ｎｏ．９２０１
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图３ 免疫后ＩＣＲ小鼠血清中抗体水平的检测
Ｆｉｇ．３ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｏｆｉｍｍｕｎｉｚｅｄＩＣＲｍｉｃｅ
（ａ）ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＩｇＧｌｅｖｅｌｉｎｓｅｒｕｍ ａ：Ｐ＜０．０１ （ｂ）ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓＩｇＡｌｅｖｅｌｉｎｖａｇｉｎａｌａｎｄｌｕｎｇｆｌｕｉｄ ａ：Ｐ＜０．０
５
图４ 免疫ＩＣＲ小鼠淋巴细胞增殖的检测
Ｆｉｇ．４ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈＩＣＲ
ａ：Ｐ＜０．０１ｖｓｇｒｏｕｐｏｆＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ
０
１
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王丹阳等：ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同ＩＬ １５作为小鼠卵透明带３
基因疫苗佐剂黏膜免疫效果的观察
图５ 各组小鼠卵巢的组织学检测（Ｈ．Ｅ染，×１００）Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅｈｉｓｔｏｌｏｇｙｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｍｉｃｅｏｖａｒｙ
（ａ）９ｇ／ＬＮａＣｌ （ｂ）Ｃｈｉ ｐｃＤＮＡ３＋ＬＰＣ （ｃ）Ｃｈｉ ＰｏｌｙＩ：Ｃ＋ＬＰＣ （ｄ）Ｃｈｉ ｐｃＤ ＩＬ １５＋ＬＰＣ （ｅ）Ｃｈｉ ｐｃＤ ｍＺＰ３＋ＬＰＣ （ｆ）Ｃｈｉ （ｐｃＤ ｍＺＰ３＋ＩＬ １５
）＋ＬＰＣ （ｇ）Ｃｈｉ （ｐｃＤ ｍＺＰ３＋ＩＬ １５＋ＰｏｌｙＩ：Ｃ）＋ＬＰＣ表１ 免疫小鼠的生育观察表（ｎ＝１０）
Ｔａｂｌｅ１ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｃｃｉｎｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ（ｎ＝１０）
组号免疫分组生育率（％）
平均幼崽数（只）
Ａ９ｇ／ＬＮａＣｌ１００９．５±２．２ＢＣｈｉ ｐｃＤＮＡ３＋ＬＰＣ９０８．２±２．３ＣＣｈｉ ＰｏｌｙＩ：Ｃ＋ＬＰＣ１００９．５±３．６ＤＣｈｉ ｐｃＤ ＩＬ １５＋ＬＰＣ９０６．２±３．７ａＥＣｈｉ ｐｃＤ ｍＺＰ３＋ＬＰＣ７０５．９±３．２ａＦＣｈｉ （ｐｃＤ ｍＺＰ３＋Ｉ
Ｌ １５）＋ＬＰＣ７０４．６±３．１ａＧ
Ｃｈｉ （ｐｃＤ ｍＺＰ３＋ＩＬ １５＋ＰｏｌｙＩ：Ｃ）＋ＬＰＣ
６０
４．２±３．４ａ
Ｎｏｔｅ：ａ．Ｐ＜０．０１ ｖｓｇｒｏｕｐ０．９％ＮａＣｌ
的，结果表明，ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同ＩＬ １５可显著增强基因疫苗的免疫效果。
本研究选用了壳聚糖包裹ｐｃＤ ｍＺＰ３基因疫苗，同时使用了能够短暂破坏上皮细胞间连接的ＬＰＣ进行处
理［
１６］
。初次免疫后第２８天和第４２天检测到ｍＺＰ３特异性的ＩｇＧ和ｓＩｇＡ，结果发现，ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同ＩＬ １５作为基因疫苗佐剂可以显著增强ｍＺＰ３基因疫苗的抗体水平，而且随着免疫后
天数的增加，小鼠血清中的抗体水平也逐渐增加。Ｍ
ＴＴ结果中ＩＬ １５和ＰｏｌｙＩ：Ｃ共免疫组与其他各组相比差异显著，表明ＰｏｌｙＩ：Ｃ能够协同ＩＬ １５显著增强ｍＺＰ３基因疫苗的淋巴细胞增殖。而且文献表明，ｍＺＰ３疫苗导致的生育率的下降，不仅与特异性抗体有关，而且与Ｔ细胞引起的卵巢炎症反应也有关
系［１７］
。卵巢的组织学结果表明，实验组卵巢泡发育异
常，而对照组卵巢泡发育正常，并且ｐｃＤ ｍＺＰ３基因疫苗引起了幼崽数的减少。所以，我们发现卵巢炎症反应可能与Ｔ细胞增殖有关，具体原因还有待进一步证实。
总之，本研究通过黏膜免疫途径，用壳聚糖包裹基因疫苗来探讨免疫不育疫苗黏膜免疫的可行性，并且研究发现ＰｏｌｙＩ：Ｃ协同细胞因子ＩＬ １５作为基因疫苗佐剂能够增强黏膜免疫反应，提高基因疫苗的免疫原性，增强基因疫苗的免疫效果，提高基因疫苗的抗生育作用，为今后基因疫苗的实际应用和进一步研制口服不孕疫苗提供了一定的参考。
参考文献
［１］ＬｌｏｙｄＭＬ，ＰａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕＪＭ，ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＳＡ，ｅｔａｌ．
spi隔离芯片１
１
