张文俊;张宇锋
【摘 要】采用无血清培养基培养表达HIR-β-NGF融合蛋白的工程细胞株CHO,收集上清后,通过浓缩、过滤预处理,并采用亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析三步法工艺对融合蛋白进行纯化,最后用Fc ELISA、CHOP ELISA、Western-blot等方法对目的蛋白进行质量检测.实验结果表明:HIR-β-NGF融合蛋白相对分子质量约为190kDa;蛋白收率达47.0%;经纯化后杂质DNA含量可降低到2.3 ng/mg以下,CHOP蛋白降到2.3 ng/mg以下,Protein A蛋白降低到49.8 ng/mg;产物仅有3.51%发生聚集;免疫印迹证明具有生物活性.该纯化工艺产品收率高,纯度高,质量检验方法稳定可靠,为大规模生产该蛋白提供参考. 【期刊名称】《天津大学学报》
【年(卷),期】2010(043)011碳纤维尾翼
微型核电池【总页数】6页(P1031-1036)
【关键词】神经生长因子;人胰岛素受体;融合蛋白;发酵纯化工艺;质量控制
【作 者】张文俊;张宇锋
【作者单位】天津大学药物科学与技术学院,天津,300072;天津大学药物科学与技术学院,天津,300072
【正文语种】中 文
【中图分类】TQ464.7
β-神经生长因子(β-nerve growth factor，β-NGF)是神经营养因子中最早被发现的，具有神经元营养和促神经突起生长等生物学功能的一种神经细胞生长调节因子.包含α、β、γ 3个亚基，其中β亚基是活性区，由2个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成[1-2].它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生具有重要的调控作用[3-4].然而作为一种药理作用明确的生物大分子，在开发成药时一方面面临β-NGF自身无法穿透血脑屏障问题[5]，另一方面也受到β-NGF在体内含量较低、来源有限的限制[6].因此如何对其进行改造并大量制备，已成为当前β-NGF研究领域中的一个极具实用价值的热点问题.
近年来，研究人员利用脑毛细血管内皮细胞膜中大量分布的转运蛋白受体，如转铁蛋白受
体、胰岛素受体等，将外源药物与这些受体的特异性抗体相连，通过受体介导的内吞作用将药物转到脑组织中[7-8].因此，笔者首先将编码人的抗胰岛素受体的抗体(human insulin receptor monoclonal antibody，HIR MAb)基因与编码人β-NGF的基因片段进行连接、转染并筛选获得稳定表达融合蛋白的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞株.然后经过发酵培养，对 HIR- β-NGF进行表达，探索三步层析大规模纯化 HIR- β-NGF的生产工艺，并对其质量检测进行研究，为HIR- β-NGF大规模生产奠定基础.
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β-NGF基因片段由中国药品生物制品检定所惠赠.SUNRISE酶标仪购自 TECAN；微型蛋白电泳装置和微型转膜装置购自Bio-Rad公司；Centriprep-30、70 mL离心超滤装置购自 Millipore公司；Centrifuge 5810R型离心机购自Eppendorf公司；96孔酶标板购自 Corning公司；SP-Sepharose FF、Q-Sepharose FF购自 GE Healthcare；Protein A 填料购自 Amersham Biosciences；8000-14000 Da透析袋购自北京索莱宝科技有限公司；Sartocon 50,kD购自Sartorius. 拼接地图
鼠抗人IgG1 Fc 购自Zymed公司；人IgG κ链标准品、碱性磷酸酶标记的羊抗人 κ链购自 Sigma公司；羊抗人 IgG(H+L)、生物素化马抗羊 IgG(H+L)、兔抗β-NGF多抗和生物素化
羊抗兔 IgG(H+L)购自 Vector公司；生物素标记的抗 Protein A、羊抗CHOP IgG、HRP标记的抗 CHOP购自 Cygnus技术公司；ABC 试剂盒和 DAB试剂盒购自 Vector Lab；PVDF Immobion-P膜购自Millipore公司；BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司；预染的标准分子量蛋白购自 Bio-Rad公司；Tris、MES、SDS和 Glysine购自BBI公司.
将β-NGF片段亚克隆至含有 HIR MAb基因的载体上，得到含有融合基因的 pHIR MAb-β-NGF质粒.用 Pvu I限制性内切酶酶切得到线性化的质粒，160,V的电压条件下电转化进入 CHO细胞.用含0.54,mg/mLG418的无血清培养基进行初筛.2周后选取阳性克隆，以不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶的CD培养基(含有 100,nm,MTX)筛选抗 MTX的细胞克隆.MTX 的量从 20,nmol/L 增加至 80,nmol/L，通过渐增 MTX的浓度使细胞中的 DHFR基因以及与DHFR基因相连的目的基因得到大量扩增，进而提高目的基因的表达量.以表达量最高的细胞株为种子细胞株，并将该细胞株扩增建立原始细胞库、主细胞库和工作细胞库并进行发酵培养.
HIR- β-NGF融合蛋白的结构示意如图 1所示，人抗HIR的免疫球蛋白IgG恒定区Fc段由二硫键相连，2个β-NGF各通过一个氨基酸的肽接头与恒定区连接.
1.3.1 Protein A亲和层析内孔撑圆涨紧夹具
用 5个柱体积的 buffer A(25,mmol/L Tris，25,mmol/L NaCl，5,mmol/L EDTA，pH＝7.1)以 3.5,mL/min的流速平衡 Protein A柱子.取 3.4,L的发酵上清，用 Sartocon 50,kD 切向流过滤系统浓缩至400,mL，并用 0.45,µm 的滤膜过滤.以 3.5,mL/min的速度将样品加到柱子上，上样完成以相同流速换用Buffer A冲洗层析柱40,min，之后用1,mol/L NaCl洗脱层析柱，换用 30,mL Buffer A 冲洗柱子，并用70,mL Buffer B (25,mmol/L Tris，1,mol/L NaCl，5,mmol/L EDTA)洗脱重组蛋白，收集流出组分，待曲线到达基线后停止收集，共得到25,mL蛋白流出液.
1.3.2 SP-Sepharose FF阳离子交换层析
用 50 mL 的 Buffer C(0.02,mol/L MES，0.25 mol/L NaCl，pH＝5.5)以3.5,mL/min的流速冲洗SPSepharose FF阳离子交换柱，并用 50,mL Buffer D(0.02 mol/L MES，0.05 mol/L NaCl，pH＝5.5)平衡层析柱.将 1.3.1节得到的 25,mL 流出液，用Centriprep-30在 1,500g的转速下离心 120,min，得到5,mL液体.加入45,mL Buffer D和10,mL去离子水后，以2.5,mL/min的速度将样品加到层析柱上.之后以3.5 mL/min的流速，先后用50,mL Buffer D、30,mL Buffer C、25,mL Buffer E(0.02,mol/L MES，0.35,mol/L NaCl，pH＝5.5)、50
mL Buffer F(0.02,mol/L MES，0.5 mol/L NaCl，pH＝ 5.5)和 50,mL Buffer G(0.02,mol/L MES，1,mol/L NaCl，pH＝5.5)洗脱层析柱，每5,mL收集流出液，用Fc ELISA方法测定流出液中融合蛋白的浓度.
1.3.3 Q-Sepharose FF阴离子交换层析动态投影灯
将1.3.2节中用Buffer C洗脱得到的27,mL洗脱液，用 Centriprep-30浓缩至 3.8,mL后加入去离子水稀释到16.8,mL，并以2.5,mL/min的速度加到已经平衡好的Q-Sepharose FF层析柱上进行进一步纯化.先后用 25,mL的 Buffer H(0.025,mol/L Na2HPO4，0.05 mol/L NaCl，pH＝7.0)、Buffer I(0.025,mol/L Na2HPO4，0.25,mol/L NaCl，pH＝7.0)、Buffer J(0.025,mol/L Na2HPO4，0.5,mol/L NaCl，pH＝7.0)和 Buffer K(0.025 mol/L Na2HPO4，1,mol/L NaCl，pH＝7.0)洗脱层析柱，每5,mL收集流出液.将用Buffer J洗脱得到的35 mL流出液，用Centriprep-30进行浓缩后，对其中的蛋白进行鉴定和质量评价.
采用双抗体夹心法测定融合蛋白的浓度.用100,µL 10,µg/mL 鼠抗人IgG1 Fc将酶标板包被过夜.次日用 PBST溶液洗板后，封闭液封闭30,min.加入100,µL 400,ng/mL、100,ng/mL、30,ng/mL、10,ng/mL、3,ng/mL、1,ng/mL和 0,ng/mL的人 IgG κ链标准品，37,℃孵育 60,
min.用 PBST洗板并加入 100,µL 0.125,µg/mL 碱性磷酸酶标记的羊抗人κ链二抗，室温孵育60,min.PBST洗板后，每孔加入100,µL PNPP试剂，暗处放置3,min，用1.2,mol/L NaOH终止反应，测定A405，绘制标准曲线并计算样品的蛋白浓度.
将 1.3.3节得到的蛋白进行还原态(reducing-PAGE)和非还原态(nonreducing-PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳，方法见文献[9] .
采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后针对 hIgG和β-NGF进行蛋白质印迹实验(Western blotting).在hIgG的Western blotting中，一抗选用羊抗hIgG(H+L)，二抗选用生物素化马抗羊IgG(H+L).在β-NGF的Western blotting中，一抗选用兔抗β-NGF多抗，二抗选用生物素化羊抗兔 IgG(H+L).二者均采用DAB显，待转印膜显合适停止显.转移膜置空气中干燥后，扫描留存转印图.
将融合蛋白的样品或标准品与蛋白变性缓冲溶液按照体积比为 1∶4混合并置于沸水中煮沸5,min，待冷却到室温后，6,000g离心 5,min，取上清待检.另取50,µL制备好的标准品或样品加入到已经用Protein A多克隆抗体包被的板条中，室温孵育60,min.用洗液洗板后加入 100,µL生物素标记的抗Protein A的二抗于孔板内，室温放置60,min.洗涤5次后加入 100 µL
碱性磷酸酶标记的 Streptavidin并洗涤板框.加入 100,µL PNPP溶液室温孵育 45,min后测定A405，绘制标准曲线并计算样品中的Protein A含量.
