张楠;熊文雯;邢媛;张炜
竹炭颗粒
【摘 要】目的:改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞.方法:选取孕期18～20 d的SD大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源.断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块.随后使用冷平衡盐溶液洗涤3次,将海马组织碎块移入酶消化液中.本方法选择Accutase和0.1％DNase作为酶消化液,37℃消化15 min,期间轻柔振动.使用冷平衡盐溶液洗涤3次,终止消化.0.1％DNase加入Neurobasal和B-27的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液.将悬液过200目筛,进行细胞计数.将过筛的单细胞悬液移入DMEM培养基(DMEM+10％胎牛血清)中,按照每平方厘米2.5×104的细胞密度进行接种.经PDL孵育的塑料片置于培养基底部.细胞于37℃、5％CO2培养箱内培养.4 h后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基.海马神经细胞于培养后7～10 d可用于实验.结果:通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态.培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98％.结论:该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效.【期刊名称】《神经药理学报》
【年(卷),期】2017(007)001
【总页数】5页(P24-28)
【关键词】平面音响细胞培养;海马;神经元;星形胶质细胞
【作 者】张楠;熊文雯;邢媛;张炜
【作者单位】中西医结合研究所,河北医科大学,石家庄,050017,中国;广东省妇幼保健院妇科,广州,510000,中国;河北北方学院,张家口,075000,中国;中西医结合研究所,河北医科大学,石家庄,050017,中国
【正文语种】中 文
【中图分类】R965.2
细胞体外培养是药理学实验的基本技术。细胞培养周期短，省时省力，能够通过人为控制
物理化学环境和培养条件，排除各种干扰因素，保持实验条件的相对稳定，完成许多在体实验无法进行的研究，是药物干预的良好模型。海马的神经功能在神经科学中占有重要地位，对体外研究神经系统疾病及细胞功能十分重要。因此，建立稳定高效的体外海马神经细胞培养方法对于开展相关实验尤为关键。现对本研究所使用的海马细胞培养方法（包括纯神经元培养、纯星形胶质细胞培养及神经元与星形胶质细胞混合培养）进行介绍。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
成年Spraguee Dawley大鼠，清洁级，♀♂兼用，体质量（250～300） g。大鼠饲养于室温（23±1） ℃，相对湿度 50%±5%，明暗各 12 h（光照时间 8：00～20：00）的动物实验室内。自由饮食、饮水，适应环境性饲养3 d，雌雄同笼配种，见阴栓后异笼饲养。
1.1.2 主要试剂
L-谷 氨 酸 盐（L-glutamine）、HEPES、葡 萄 糖（glucose）、维生素 A（Vit-A）、维生素 E（Vit-E）、多聚赖氨酸（poly-D-lysine，PDL）、谷胱甘肽、青霉素 /链霉素（penicillin/streptomycin，P/S）、五氟尿嘧啶，均购自美国Sigma公司生产；Accutase酶，购自美国Millipore公司；DNA酶，购自日本TaKaRa公司；胎牛血清（FBS）、高糖DMEM、Neuronbasal培养基、HBSS、Hibernate-E、B27、丙酮酸钠，均购自美国Gibco公司。
1.1.3 实验仪器
FV1200型荧光显微镜，日本OLYMOUS公司；DK-S11型电热恒温水浴锅，中国上海森信实验仪器有限公司；细胞培养箱，Biological Industries公司。
钛合金热处理1.2 实验方法
1.2.1 配制相关培养基
1.2.1.1 配制葡萄糖-HEPES混合液（50×） 葡萄糖3 g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES） 1.192 g 溶于 10 mL PBS后配
成50×母液，0.22 μm滤膜过滤后4 ℃保存。该溶液溶解较慢，4 ℃需要溶解3～5 d。
1.2.1.2 配制DMEM培养基 高糖DMEM+10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），0.22 μm 滤膜过滤后4 ℃保存。
1.2.1.3 配制CDM培养基 维生素A（vitamin A，Vit-A）（避 光）0.2 μmol·L-1；维 生 素 E（vitamin E，Vit-E） 3 μmol·L-1；L-谷氨酸盐 5 mmol·L-1；谷胱甘肽4 μmol·L-1；丙酮酸钠 1 mmol·L-1；葡萄糖 -HEPES 1×；B-27 1×；青霉素 /链霉素（penicillin/streptomycin，P/S）50 U·mL-1。Neurobasal稀释，现用现配，0.22 μm 滤膜过滤后4 ℃保存。
1.2.2 细胞培养
参照 Vicario-Abejón 的方法［1］。选取孕期 18～20 d的SD大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。孕期以见到阴栓之日开始计算。孕鼠用乙醚麻醉后，行剖腹产。手术器械应提前高压灭菌，并干燥冷却。整个操作过程应严格遵循无菌原则。在所需数量胎鼠断头之前，应控制麻醉深度，保证孕鼠存活。如孕鼠死亡，胎鼠的神经元质量将受到很大影响。
此处建议将子宫打开后，逐个剖出胎鼠断头。如将整个子宫取出，再剖出胎鼠，将导致后剖出的胎鼠缺氧时间过长，呈现青紫，影响神经细胞质量。
果冻蜡烛胎鼠断头后，将头部置于冰冷的Hank’s平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）中。之后，在冰冷的Hibernate-E溶液中将整个脑组织剥离出来。显微镜下，严格去除大脑表面的血管膜，剥离双侧海马组织，此过程仍然在冰冷的Hibernate-E溶液中进行。剥离一对海马的时间应控制在2 min以内。
利用眼科剪，将海马组织剪碎成约1 mm3的小块。随后使用冰冷的平衡盐溶液HBSS洗涤3次，弃上清。之后对海马组织碎块进行消化。本研究所使用Accutase酶+0.1% DNA酶（DNase）作为消化液。37 ℃消化15 min。每5 min轻柔摇动一次。消化期间应提前将后续步骤所需液体（DMEM培养基、吹打液、细胞计数的台盼蓝）准备好，以尽量缩短实验时间。
广告伞制作消化完毕后，再次使用冰冷的平衡盐溶液HBSS洗涤3次，终止消化。之后用1 mL吹打液（Neurobasal+2%B-27+0.1% DNase，Neurobasal+2% B-27需提前配好，经0.22 μm滤膜过滤后4 ℃保存。DNase现用现加。）对消化后的海马组织碎块进行吹打，以获得单细
胞悬液。该过程极为关键，也是新手掌握该技术的主要难点之一。吹打以看不到沉淀组织为准，吹打过程应控制在15次以内，且不能出现气泡。吹打次数过多及气泡的出现，都会导致细胞的损伤。
吹打完毕后获得细胞悬液，置于15 mL离心管内，培养箱静置30 min。利用差速黏附的原理，去除沉降较快的成纤维细胞。取上清液过200目筛。取10 μL过筛后细胞悬液，与台盼蓝1∶1混匀，于计数板上进行细胞计数。按照2.5×104·cm-2细胞数目进行接种。用于接种的塑料片、培养皿或培养瓶应提前用多聚赖氨酸（poly-D-lysine，PDL）进行孵育。本研究所使用的PDL 浓度为 0.1 mg·mL-1，分子量为 70 000～150 000。
将过筛后的单细胞悬液移入DMEM培养基中，吹打混匀后接种。细胞于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。从胎鼠断头至此，时间应控制在1.5 h之内。
若需对海马神经元及星形胶质细胞进行混合培养，则4 h后，吸除原有培养基，更换为CDM培养基，每 3 d 半量换液［2］。
若需培养纯海马神经元，则4 h后，吸除原有培养基，更换为CDM培养基。3 d后第一次换
液时，更换为含有10 μmol·L-1五氟尿嘧啶的CDM培养基，用以杀死胶质细胞。于下一次换液时更换为普通的CDM培养基［2，3］。
