毛蕊花糖苷抑制脂多糖诱导的BV—2小胶质细胞炎症反应及机制研究 探究毛蕊花糖苷（acteoside，ACT）对细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症反应的抑制作用及潜在机制。该实验以LPS诱导BV-2细胞作为炎症模型，将BV-2细胞分为正常对照组、模型组、给药组，ACT按指定浓度（12.5，25，50 μmol·L-1）作用于细胞。采用NO试剂盒检测NO炎症因子的释放量，ELISA法检测TNF-α和IL-6的表达量，Western blot法检测炎症相关蛋白（iNOS，COX-2，p-IKKβ，IKKβ，p-IκB，IκB）的表达。此外，通过检测细胞核/浆中NF-κB p65的表达以及借助免疫荧光技术，阐明ACT对炎症转录因子NF-κB p65核转位的作用。结果显示，ACT可显著降低LPS诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症，且呈剂量依赖性。具体表现在：显著降低炎症因子NO，IL-6和TNF-α的释放量，抑制炎症相关蛋白iNOS和COX-2的表达。同时，ACT可明显抑制NF-κB信号通路中关键蛋白IKKβ和IκB的磷酸化，且明显抑制NF-κB p65的细胞核转位。以上结果表明，毛蕊花糖苷可显著降低LPS诱导的小胶质细胞神经炎症反应，抑制炎症相关蛋白的表达，其潜在机制是通过抑制NF-κB信号通路实现的。 标签： 神经炎症；小胶质细胞；细菌脂多糖；毛蕊花糖苷；NF-κB通路
[Abstract] To investigate the inhibitory effects of acteoside （ACT） on BV-2 microglial cells and the potential mechanism，LPS was used to treat BV-2 cells with or without ACT （12.5，25，50 μmol·L-1）. Then， the expressions of inflammatory factors （NO，TNF-α，IL-6） and inflammation related proteins （iNOS，COX-2，p-IKKβ，IKKβ，p-ⅠκB，ⅠκB） were detected. In addition，the nuclear translocation of NF-κB was explored. The results showed that ACT could significantly suppress the inflammatory response against LPS stimulation by decreasing the expressions of NO，IL-6，TNF-α，iNOS，COX-2 and the phosphorylations of IKKβ and IκB. Moreover，the nuclear translocation of NF-κB p65 was inhibited by ACT. Taken together， ACT could significantly inhibit the inflammatory response of BV-2 microglial cells which were induced by LPS via inhibition of NF-κB signaling pathway.
[Key words] neuroinflammation；microglial cells；lipopolysaccharide；acteoside；NF-κB signal pathway
doi：10.4268/cjcmm20161322
阿尔兹海默症（Alzheimer′s disease，AD）是一种常见的多病因中枢神经系统退行性疾病，为老年人痴呆症的主要类型之一。已有研究表明，AD患者脑内存在大量炎症特性，如炎症细胞因子及趋化因子增加，损伤部位小胶质细胞过度激活而聚集等[1]。目前发现，可以过度激活小胶质细胞的因素非常多，如LPS[2]，炎症因子（TNF-α，IL-6等），淀粉样蛋白（Aβ）等，这些炎症信号可通过各种传导通路作用于脑部，进而激活小胶质细胞[3]。
毛蕊花糖苷（acteoside，ACT）是列当科肉苁蓉的主要活性成分之一，现代药理学研究发现，在以冈田酸诱导的阿尔茨海默病（AD）细胞模型中，ACT能够通过抑制tau蛋白过度磷酸化来发挥神经保护作用[4]。还可能通过抑制小鼠脑皮层组织中caspase-3基因表达，维持皮层组织神经细胞的正常形态及数量，实现对小鼠脑损伤的保护作用[5]。本实验从抗炎角度，以LPS诱导BV-2小胶质细胞炎症模型为研究对象，旨在探究毛蕊花糖苷的抗炎作用及潜在机制，为其防治神经系统退行性疾病提供理论与实验依据。
1 材料
1.1 细胞 BV-2小胶质细胞系购自中国医学科学院细胞中心。
1.2 药物 毛蕊花糖苷购自宝鸡市辰光生物科技有限公司。
入口雨棚
1.3 试剂与仪器 DMEM培养基（Macgene）；胎牛血清（PAN Biotech）；NO化学法试剂盒（南京建成）；溴化噻唑蓝四氮唑（MTT），荧光染料4’雨水循环系统， 6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma）；ELISA试剂盒（Excell Biotech）；细胞核/浆蛋白提取检测试剂盒（南京建成生物公司）；蛋白抗体（Cell Signaling Technology）；Tanon-5200Multi凝胶成像分体系统（天能）；Sunrise-Basic酶标仪（TECAN）；TCS SP5-Confocal-MP-FCS（Leica）。
秸秆发酵剂2 方法
2.1 细胞培养与处理 BV-2小胶质细胞系用高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清，100 U·L-1青霉素，100 μg·L-1链霉素）进行传代培养，每天传代1次。将细胞分为空白组，模型组和不同浓度药物处理组（12.5，25，50 μmol·L-1）组。LPS诱导炎症模型的质量浓度为1 mg·L-1。
2.2 MTT法检测细胞存活率 BV-2细胞系以5×104密度接种于48孔板，培养过夜，模型组用LPS诱导炎症，药物处理组按照上述3种浓度，同时处理细胞，24 h后弃上清，加MTT （0.5 g·L-1）染，温箱孵育2 h；弃上清，加入DMSO，酶标仪检测吸光度（A570 nm）。
超导失超
2.3 细胞上清液NO含量测定 BV-2小胶质细胞系接种于48孔板，密度为5×104个/孔，模型组LPS诱导炎症，药物处理组按上述3种浓度给药，NF-κB通路抑制剂组（Bay 11-7082，5 μmol·L-1）同时处理。24 h后用NO化学法试剂盒检测NO浓度，按照说明书操作，最后用酶标仪检测吸光度（A570 nm）。
园林音箱2.4 ELISA检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达 将细胞接种于48孔板，密度为5×104个/孔，12 h后，按照上述分组处理细胞，到达指定时间后，收集上清200 μL/孔。按照说明书操作，最后用多功能酶标仪检测吸光度（A450nm）。
2.5 Western blot蛋白免疫印记分析 按上述分组处理细胞，分别作用24 h（测iNOS，COX-2）、1 h（测IκB，p-IκB，NF-κB）、10 min（测IKK，p-IKK）后，收集各组细胞并用RIPA裂解液（内含蛋白酶抑制剂）裂解细胞，获得总蛋白。然后采用6%～15% SDS-PAGE分离蛋白，半干法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭20 min，加入一抗（1∶1 000），室温孵育2 h，充分洗涤，加入二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，充分洗涤后，加ECL试剂显，在凝胶成像系统上拍照。用Gel-Pro软件进行条带的吸光度积分分析。
2.6 免疫荧光检测核转录因子-κB （NF-κB p65）核转位情况 将显微镜盖玻片铺到24孔板中，以3×104个/孔接种细胞，培养过夜，分为对照组、模型组和50 μmol·L-1药物处理组，温箱孵育1 h后，4%多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton X-100处理细胞30 min，加入封闭液（5% BSA in PBST），室温封闭30 min。然后加一抗（1∶200），4 ℃过夜，PBS冲洗3遍，加荧光二抗（1∶200）孵育1 h，PBS冲洗3遍，再用DAPI（50 mg·L-1）避光处理20 min，PBS洗3遍，甘油封片，最后用共聚焦显微镜拍照。
2.7 统计学分析 所有数据用±s表示。采用GraphPad Prism 5统计学软件进行t检验和单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学意义。
3 结果
3.1 ACT对细胞存活率没有影响 结果显示，ACT在12.5，25，50 μmol·L-1 3个浓度剂量下，对小胶质细胞的存活率无显著性影响，表明在此实验条件下，ACT对细胞无明显毒性（图1）。
3.2 ACT显著抑制LPS诱导的BV-2细胞中NO，TNF-α和IL-6的释放 模型组NO释放量显著高
汽车半轴套管于正常组（P＜0.001）；与模型组相比，ACT剂量依赖性的抑制BV-2细胞中NO的产生，具有显著性差异。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为炎性细胞因子，可引起发热，并刺激炎症因子白介素-6 （IL-6）的产生。在实验中，LPS刺激后，细胞分泌的TNF-α与IL-6显著提高。ACT干预后，可显著降低TNF-α及IL-6的释放，药物处理组与LPS诱导组相比，存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.001）。由此可见，ACT具有较好的抗神经炎症作用（图2）。
3.3 ACT显著抑制LPS诱导的BV-2细胞中iNOS和COX-2蛋白的表达 诱导性NO合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）是核转录因子NF-κB p65调控的2个重要炎症相关蛋白。当炎症发生时，小胶质细胞显著活化，iNOS和COX-2会相应的催化产生大量NO等炎症因子，进而造成神经炎性损伤，诱导细胞凋亡[6]。实验中，采用Western blot方法检测此2种蛋白的表达，相比于LPS模型组，ACT可明显降低iNOS和COX-2的表达，且呈剂量依赖性（图3）。
3.4 ACT显著抑制NF-κB炎症信号通路中关键蛋白的激活 通过Western blot法检测NF-κB通路中关键蛋白的表达，当LPS刺激细胞后，IKKβ表达量不变，IκB的表达量显著降低，而二者的磷酸化产物表达量均显著升高。加入ACT进行干预后，IKKβ和IκB的磷酸化产物成剂
量依赖性降低，另外IκB的表达量显著升高，且具有统计学意义，表明ACT可明显抑制NF-κB通路的激活（图4）。
3.5 ACT抑制LPS诱导的BV-2细胞中NF-κB的核转位 NF-κB是参与炎症反应的一个重要转录因子。在静息态细胞中，NF-κB与抑制因子IκB形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中，受到外界信号（如LPS）刺激后，经过一系列反应，NF-κB从胞浆转移到胞核，促进相应基因转录表达，调节炎症因子的生成[7]。从本实验结果（图5）可以看出，LPS模型组中，胞浆内NF-κB p65含量明显低于空白组，加ACT（50 μmol·L-1）干预后，其在胞浆中含量明显升高。说明ACT可一定程度上抑制LPS刺激的NF-κB p65核转位现象。另外，通过Western blot法分别检测了胞核与胞浆中NF-κB p65蛋白的表达。在空白组中，NF-κB p65主要存在于细胞浆；模型组NF-κB p65入核明显，胞浆中的含量明显下降；ACT干预后，NF-κB p65分布再次以胞浆为主（图6）。由此再次证明，ACT可抑制LPS诱导的NF-κB p65核转移。此外，加入NF-κB抑制剂Bay 11-7082后，BV-2细胞中的NO释放量明显降低（图6），这也进一步证实了NF-κB信号通路在调节神经炎症过程中的重要性。总之，这些结果为进一步阐明ACT的抗炎机制提供了有益的参考。4 讨论
神经炎症是除Aβ沉积和tau蛋白磷酸化外，导致多种急慢性神经退行性疾病的重要因素[8]。小胶质细胞被公认为定居在脑内的巨噬细胞，在调节AD的慢性炎症中发挥主要作用，一方面，小胶质细胞的激活可以清除脑内细胞碎屑、凋亡的神经元细胞以及潜在的有害物质，维持正常的中枢神经系统环境；但另一方面，当小胶质细胞被特定因素（如LPS）过度激活时，其分泌多种炎症因子并能导致神经退行性疾病的发生，这些炎症因子又会反过来促进小胶质细胞的聚团、活化，从而形成恶性循环[9]。因而，寻能够降低脑内炎症反应的药物具有非常重要的意义。
