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【关键词】 红外荧光扫描成像系统 Western印迹法
Odyssey红外荧光扫描成像系统(Infrared Imaging System)是一套具有高灵敏度的实验系统，在医院、科研院所中得到越来越多的应用，日益受到人们的关注和青睐。现将Odyssey工作原理与技术特点、应用范围、操作流程、常见问题及解决策略等介绍如下。
1 Odyssey工作原理与技术特点
Odyssey是通过在二抗上标记荧光染料，再通过固定波长激光激发后，采集染料发出荧光信号来确定目的蛋白含量的技术系统。相对于传统化学显法(如DAB显)、化学发光法(如ECL)等，Odyssey有较大改进。烧结烟气脱硫
Odyssey系统可直接在膜、凝胶和微孔塑料板中对样品进行检测，该系统采用2个红外激光作为激发光，波长分别为680 nm和780 nm，检测则配置2个720 nm和820 nm波长高灵敏度二极管。Odyssey优于传统方法的主要特点是高灵敏度。一般荧光染料激发和检测波长都在可见光谱区，在此范围内膜、凝胶和微孔塑料板也会发出荧光，容易产生高背景荧光干扰，影响实验结果，而Odyssey采用红外波长区，此时大分子物质几乎不发出任何荧光，在检测中背景荧光很低，从而有较好信噪比。Odyssey另一特点是直接检测，可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。IRDyes染料最大吸收值与Odyssey两个激发波长相匹配，其发射波长又与Odyssey两个检测波长相匹配，同时发射波长峰值相隔100 nm，这使Odyssey有较大灵敏度和较小信号交叉。Odyssey系统检测不需要曝光和底物显，也不需要X光片，操作简便，另外配有功能全面的软件支持，结果分析如生物大分子分子量确 定、定量及图像处理也很容易。Odyssey系统操作简单，双检测，可一次同时检测两种目的分子，这样更直观、更省时。由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有更长使用寿命，且维护要求也低。
2 Odyssey应用范围
Odyssey系统应用包括蛋白质和核酸研究，如Western分析、InGel Western分析、蛋白质定量分析、双磷酸化分析、考马斯亮兰胶的扫描、蛋白双向电泳、双 EMSA、双微孔板分析、BD PowerBlot Analysis、Northern Blot、Southern Blot等。
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光盘封套 Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显或放射自显影以监测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。主要用于检测蛋白水平的表达。Western显影的方法主要有以下几种：放射自显影、底物化学发光(ECL)、底物荧光ECL、底物DAB显。 化学显法操作简便，无需暗房和显影设备，显直观，但灵敏度较低。ECL比化学显法灵敏度高，可达纳克(ng)水平，但由于是酶促反应，不同曝光时间得到信号与样品量不成线性关系。Odyssey和ECL相对灵敏度相差不大。Odyssey具有更好的线性关系和更精确的定量结果，能同时看到Marker 和目标蛋白，ECL看不到 Marker。Odyssey即基于这一原理，设计出荧光标记二抗(IRDye 700和IRDye 800)，能做到较精确检测。
vlanid 3 Odyssey操作流程
一个基因表达结果是产生相应蛋白，检测蛋白是测定基因表达的主要标志。Odyssey检测就是在传统基础上发展的一种新检测方法Western印迹法，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的特定蛋白。将凝胶上蛋白转移到硝酸纤维素膜上并首先使用一抗孵育，然后再用二抗结合，Odyssey所用二抗经荧光(IRDye 700和IRDye 800)标记，因此不需要传统方法中的显步骤，可直接扫描。Odyssey操作流程如下：①电泳：提纯细胞蛋白，并取适量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)［1］。②平衡：PVDF膜先用甲醇
浸湿，后用去离子水冲洗，最后在转移缓冲液中平衡20 min。凝胶也置转移缓冲液中平衡20 min，同时裁两张与胶同样大小滤纸，置缓冲液中平衡。③转膜的基本顺序：负极－滤纸－凝胶－PVDF膜－滤纸－正极，电压15 V，时间30 min。完毕后在封闭液中封闭1～3 h。④结合：封闭液稀释一抗(比例1∶1 000～1∶5 000)，将PVDF膜一抗中室温1 h以上或4℃过夜后用PBST于摇床洗膜4×5 min。封闭液稀释二抗(比例1∶20 000)，PVDF膜二抗中室温于摇床1 h(避光)［2］。⑤洗膜：用PBS洗去膜上残留Tween20，随后进行直接扫描。⑥数据收集及分析。
4 Odyssey常见问题及解决策略
4.1 高背景，但是均匀分布 可能原因及对策：封闭液中BSA的存在，可不用BSA封闭；没有使用最佳封闭试剂，可通过实验获得最适合自己体系的封闭液；封闭时间过长，膜上抗体浓度太高，洗膜不彻底，应增加洗膜次数和洗膜液的量；封闭液有污染，污染物和抗体发生交叉反应，如牛奶里经常会有IgG,和二抗发生交叉反应，应选用Odyssey配套的封闭液，而不是牛奶；使用抗体量不合适，一般应减少抗体量并使膜完全浸没其中；此外操作要小心，处理膜时使用镊子，避免膜干燥。
4.2 背景有不均匀斑点分布 可能原因及对策：封闭液同时处理多张膜，应确保封闭液量没有发生污染并保证所有膜都接触到溶液；膜没有始终保持湿润，部分被吹干，注意保证膜始终保持湿润状态，特别是重复使用膜时尤为重要；使用的镊子和容器被污染，脏的镊子会将染料带到膜上而无法洗脱，所以镊子在接触过抗体特别是染料标记的二抗后必须要洗干净。
4.3 信号微弱或无信号 可能原因及对策：蛋白转移没有成功，应检查转移液是否正常及转膜过程各步骤是否正确；检测过程中蛋白从膜上丢失，应缩短封闭时间；蛋白样品量不足，可增加上样量；使用抗体量不足，所以增加抗体量，优化最适浓度；转移过程中蛋白没有保留在膜上，转膜后应先让膜在空气中自然风干，再去封闭，这样能使蛋白结合得更为牢固，此外应根据所用抗原对转膜条件和时间进行优化。
4.4 出现非特异性或非预期条带 可能原因及对策：抗体浓度过高，应减少抗体用量；双实验中抗体间交叉反应，应对所用一抗和二抗来源、种属再次检查；信号从一个通道流失到另一通道，应扫描时改变通道的激发强度。
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【参考文献】
