国际生物制品学杂志2()2丨年6月第44卷第3期Int J Biologicals, June 2021, Vol. 44, No. 3
关文竹K2火文K2傅生芳h2高晶晶h2马超1李雄雄h2王云瑾h2董晖1’2白慕h2 1兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室730046; 2甘肃省疫苗工程技术研究中 心，兰州730046
通信作者：白慕，E m ail:baimuqun@163
【摘要】目的建立人3型副流感病毒（human parainfluenza virus type3, HPIV3)感染小鼠模型，并研究其免疫应答特点。方法用HPIV3兰州分离株HPIV3LZ1728C19毒株鼻腔接种BALB/c小 鼠，每天检测体温和体质量。用ELISA检测血清HPIV3特异性IgG、IgA滴度，实时定量PC R检测鼻 腔灌洗液和肺组织病毒滴度，流式细胞术检测外周血、肺、脾淋巴细胞中的HPIV3特异性IFN-y CD4 +和1FN-7 CD8+T细胞，酶联免疫斑点法检测分泌HPIV3特异性IgG/IgA的B淋巴细胞，肺组织切片 观察病理变化。结果感染后第3天，小鼠鼻腔和肺的病毒负载量分别到达峰值1()4拷贝/m l鼻洗液和 1()7拷贝/g组织，肺部发生炎症性病理变化。感染组早期体质量增加显著滞后于对照组（感染后第3 天:f= 4.64，P<()•05)。感染组血清中 HPIV3 特异性 IgG(r= 2.94，P<0•05)和IgA水平（f= 18.66，P<0.()5)显著增高，外周血、肺、脾均 出现HPIV3特异性抗体分泌淋巴细胞。病毒感染诱导小鼠肺产 生记忆性正心7〇)8+丁和《^-)^04+丁细胞应答，脾和外周血产生《^-7〇)4+丁细胞应答。结论 成功建立了 HPIV3感染小鼠动物模型，感染小鼠产生了显著的肺黏膜体液和细胞免疫应答。
乙酰正丙醇
【关键词】人3型副流感病毒；动物模型；免疫应答
【中图分类号】R392 DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20200916-00092
Establishment of a mouse model of human parainfluenza virus type 3 infection and characterization of immune responses
Guan Wenzhu1,2 , Huo Wen1,2 , Fu Shengfang1 '2 , Gao Jin g jin g''2 , Ma Chao1,2 , Li Xiongxiong1,2 , Wang Yunjin1,2 , Dong H u i1,2 , Bai Muqun1,2
1 The Second Research Department, Lanzhou Institute o f Biological Products Co.，L td.，Lanzhou 730046，China; 2Center fo r Gansu Provincial Vaccine Engineering Research，Lanzhou 730046，China Corresponding author ：Bai Muqun , Email：****************
【Abstract】Objective To establish an animal model of human parainfluenza virus type 3CHPIV3) infection in mice，and characterize the immune responses of the HPIV3 infected mice. Methods BA
数据采集系统方案LB/c mice were infected intranasally with wild strain HPIV3LZ1728C19 isolated from clinical specimens. The body mass and temperature of infected mice were measured daily for 30 d. The titers of HPIV3-specific IgG and IgA in serum were detected by ELISA, and the viral titer in nasal lavage and lung tissue were detected by quantitative real-time PCR The HPIV3-specific IgG and IgA antibody secreting cells (ASCs) and the HPIV3-specific IFN-y CD4+ /CD8+T cells in lymphocytes isolated from lung, spleen and peripheral blood were detected by enzyme-linked immunospot assay and flow cytometry, respectively. The pathological changes in lung tissue were observed by lung slice. Results The HPIV3 replicated and viral loads peaked ( 104copies/ml nasal lavage and 1()7copies/g lung tissue) at post infection day 3 (PID3) in infected mice. HPIV3 infection significantly lowered the body mass gain of mice at early stage of infection ( / = 4. 64, P <0. 05 at PID3), and resulted in inflammatory pathological changes in lung tissue. The HPIV3 specific IgG ( / = 2. 94, P <0. 05) and IgA (t =18. 66, P <0. 05)
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antibody levels were significantly higher in infected mice serum than control, with virus-specific ASC
responses in all 3 kinds of tissues. Virus infection induced HPIV3-specific IFN-y CD8+T cell response in
lung, and HPIV3-specific IFN-y CD4+T cell response in spleen and peripheral blood. Conclusions A
mouse model of HPIV3 infection is successfully established. Lung mucosal humoral and cellular immune
responses are induced in BALB/c mice infected intranasally with HPIV3.
触摸笔无人驾驶系统【Key words】Human parainfluenza virus type 3; Animal model; Immune response
D()I：10. 3760/cma. j. cn311962-20200916-00092
人 3 型副流感病毒（human parainfluenza virus type3，HPIV3)感染可引起1岁以内婴幼儿肺炎和 支气管炎，因下呼吸道感染的住院患者中〗2%是由 HPIV3感染造成的[w]，在先天肺部异常或免疫功 能低下的成年人中HPIV3感染不仅会引起严重的 下呼吸道疾病，还可诱发肺功能下降、多器官衰竭等 多种并发症，造成较高的死亡率[57]。对HPIV3感 染的预防和，目前还没有批准上市的疫苗和药 物[89]。HPIV3疫苗的研发大多处于临床前研究阶 段，最初的灭活疫苗因药物不良事件DH]已被完全放 弃，因此减毒活疫苗和亚单位疫苗是HPIV3疫苗 研究的主要方向[11]。本研究的目的是建立H H V3 感染的小鼠模型，并研究感染期间小鼠的体液和细 胞免疫应答的特点，为HPIV3候选疫苗的筛选提 供便捷有效的评价工具。
1材料与方法
1.1细胞
WI-38和MA104细胞均由兰州生物制品研究所 有限责任公司(兰州公司)第二研究室传代并保存。1.2病毒
HPIV3LZ1728C19病毒株由兰州公司第二研究室从兰州地区肺炎患儿下呼吸道痰标本中分离，在WI-38细胞中增殖，克隆纯化，去除包括支原体 在内的特定外源因子。
1.3主要试剂和仪器
辣根过氧化物酶（H RP)标记的抗小鼠I g A和抗小鼠IgG(H+ L)、佛波酯+离子霉素、mouse BD Fc Block(抗小鼠CD16/CD32)、异硫氰酸荧光素标 记的大鼠抗小鼠CD4、藻红蛋白标记的大鼠抗小鼠 CD8a、别藻青蛋白标记的大鼠抗小鼠IFN-y、PerCP-Cy5. 5标记的抗小鼠CD3、布雷菲德菌素(brefeldin A，B F A)、细胞固定/细胞破膜溶液试剂 盒、Stain Buffer均购自美国B D公司，TrueBlue™Peroxidase Substrate显剂购自美国K P L公司，RNeasy mini k it试剂盒购自美国Q IA G EN公司，OneStep PrimeScript™RT-PCR Kit购自曰本T aK aR a公司，细胞培养液DMEM、RPMI164()均 购自美国Thermo F ish e r公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FB S)购自 ExCell Bio
公司，HEPES 缓冲液购自美国Sigm a公司，鼠淋巴细胞分离液购 自深圳达科为生物技术股份有限公司。
Forma Series[I Water Jacketed C〇2 培养箱、1300SeriesA2 生物安全柜、7500 Real Time PCR System均购自美国 Thermo Fisher公司，Allegra® 64R Centrifuge台式离心机、Allegra® X-15R Centrifuge台式离心机均购自美国Beckman公司，A ccuri™C6流式细胞分析仪购自美国B D公司，Elispot/FluoroSpot Reader System 购自德国 AID 公司，Spectra Max M3酶标仪购自美国Molecular Devices公司。
1.4实验动物
无特定病原体级2周龄雌性B A L B/c小鼠，体 质量13. 5〜14. 5 g，由兰州公司动物室提供并伺养，实验动物生产许可证号:SCXK(甘)2(>17-0(K>1.
1.5小鼠免疫
将小鼠简单随机分为6组，每组21只。1一5 组小鼠为实验组，每只经鼻腔接种HPIV3病毒培 养液20 (滴度8.6 X1()»拷贝/ml)，分别在接种后 第3、10、20、30、40天各取1组，眼球取血，分离血 清，用间接E L IS A检测血清IgG、Ig A抗体滴度；其 余全血提取淋巴细胞，计数待用；同时取50 小鼠 鼻腔
灌洗液及5() m g肺组织提取R N A，用实时定量 P C R检测H H V3滴度；取脾、肺提取淋巴细胞.计 数待用。第6组为对照组，与实验组分开词养，每只 小鼠接种2() DMEM，不做任何处理。连续3() d 检测实验组和对照组小鼠体质量及体温。
1.6鼻腔灌洗液和肺组织R N A提取
按照RNeasy mini k it试剂盒说明书所列方法 提取R N A，将纯化的病毒R N A置(）°C冰浴备用。
1.7上、下呼吸道HPIV3滴度检测
用 One~Step PrimeScript™RT-PCR Kit完成 TaqM an探针实时定量PCR.引物（realHNS /
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realHNA)和探针HNprobe序列均位于HPIV3的
H N基因上，序列未公布。标准曲线用4.7 x iW〜
4.7\1〇7拷贝/…11的体外转录^^1^八建立。反 应体系：2 X 〇ne step RT-PCR buffer I H1()p i，Takara Ex TaqHS(>.4 y l，PrimeScript RT Enzyme Mix II()• 4 H l, 2 种引物（均为 1()pmol/jul)各0. 6 /ul，探针（1()pmol/VlH). 2 M l，5()x R〇X参比染 料().4 p l，RNA模板 2 p l，RNase free H20
5. 4 pi。扩增程序:42 °C 5 min、95 °C 1()s解离；95 °C 5 s、57 °C 34 S,4()个循环扩增。
1.8病理观察
取不同感染天数的小鼠肺，40%甲醛固定后切 片观察病理特征，由兰州大学基础医学院病理教研 室完成。
1.9淋巴细胞分离
外周血：每只小鼠眼球取血〇. 5 m l左右，滴人1. 2 m l枸橡酸抗凝剂中混匀，加入1.7 ml RPMI1640混匀，用反推法缓慢在底部推人1. 7 ml 淋巴细胞分离液；脾、肺：无菌取出小鼠脾和肺，在 200目研磨网上用小鼠淋巴细胞分离液研磨，7只小 鼠的肺或脾脏研磨液放入1个15 m l离心管，用淋 巴细胞分离液定容至1〇 ml。在离心管上端覆盖 1.5 ml的RPM I1640。以上溶液在800 X旦4 °C离 心20 m in后吸出淋巴细胞层，加人10 ml RPMI1640洗涤、离心，用无血清RPMI1640重悬细 胞后计数，37 °C保温备用。
1. 10 HPIV3特异性T细胞检测
将病毒培养液在8 00() X g离心30 min，上清液 加于50%蔗糖上，35 000 X g离心4 h，沉淀用适量 DM EM重悬，测定纯化抗原的蛋白浓度，用免疫印 迹法鉴定其血凝素-神经氨酸酶（HN)蛋白和融合 (
F)蛋白。
将分离的淋巴细胞稀释至1X 107个/ml，加人 V底％孔板中，每孔100 H l，实验组每孔加人12
蔗糖密度超离心纯化的H H V3抗原，37 °C，5% C02孵育14 h。每孔加入1p i蛋白转运抑制剂 B F A，继续孵育至17 h，离心收集细胞。设置阴性 对照和阳性对照，阴性对照不使用抗原刺激，阳性对 照加人佛波酯+离子霉素以及B F A，37 °C，5% C02孵育6 h，离心收集细胞。用抗小鼠CD4、CD8a、CD3、IFN-7抗体分别染，进行流式细胞分 析。分别设置CD3、CD8、CD4、IFN-7单染对照 管，用于调节补偿。1. 11 HPIV3特异性IgG/IgA抗体分泌淋巴细胞 (antibody secreting cell，ASC)检测
使用酶联免疫斑点法（enzyme~linked immunospot assay，ELIspot)检测，将 5X 1〇5 个/ml M A104细胞加人96孔细胞培养板，2(>0 H l/孔，37 °C培养72 h，用1 : 2 ()()()稀释的HPIV3病毒培 养液感染细胞，37 °C培养72 h后固定，-20 °C保存 备用。将脾、肺、外周血中提取的淋巴细胞分别稀释 为5X l〇6、5X l〇5、5X l〇4个/ml，加人制备的96孔 板，设置复孔。50(>Xg 离心 5 min，37 °C、5%C02孵育12 h，用PB&Tween20(PBST)缓冲液洗板6 次，加人抗鼠Ig A或Ig G抗体，5()pi/孔，37 °C、5%
C02孵育 2 h，用P B S T清洗6次。加人TrueBlue™Peroxidase Substrate 显剂，5() /nl/孔，37 °C、5%C02孵育2 h，读取每孔蓝斑点数。
1. 12血清中IgG、Ig A抗体检测
使用间接E L IS A，用5哗/m l蔗糖密度超离心 纯化的HPIV3抗原包被酶标板，50 jul/孔，4 °C过 夜，20%F B S封闭，37 °C放置2 h。对小鼠血清进 行4倍系列稀释加人酶标板中，5()M l/孔，每个稀释 度2孔，同时设置阴性对照孔。37 °C放置1h，用 P B S T洗板6次，加人50 M l/孔H R P标记的抗鼠IgG、Ig A抗体，37 °C放置1h，用P B S T清洗6次，加人50 p i显底物H202/TM B，37 °C放置10 min 后终止反应，使用酶标仪检测450 nm吸光度（A)值。抗体滴度判定标准：以A值高于阴性血清A值2.5倍的血清最高稀释度为抗体滴度。
1.13数据分析
用 GraphPad Prism7.()软件，用 Welch校正的 非配对f检验进行差异分析，P<〇.05为差异有统计 学意义。
2结果
2.1体质量、体温变化
病毒感染后，每天检测对照组和感染组小鼠体 温和体质量，持续3(1d，结果见图1。在接种病毒后 第 1 天（post infection day 1，PID1)，感染组小鼠体 质量开始低于对照组，HD3体质量差异达到最大(
感染组 14. 5 g± (). 1g，对照组 15. 9 g± (). 1g; f= 4. 64，P<0.05，n= 21)，随后体质量差异逐渐缩 小，直到PID23达到一致。体温监测结果显示，感 染后30 d内两组小鼠体温均在正常范围内波动，差 异无统计学意义(《= ().56，尸=().56，n= 21)。
2.2上、下呼吸道病毒增殖情况
• 142 •
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图1人3型副流感病毒感染对小鼠体质量和体温的影响A
体
质量B
体温
提取感染后不同时间点小鼠鼻腔灌洗液以及肺
组织中的R N A ，用实时定量P C R 检测病毒负载量， 见图2。结果显示，接种后，病毒在小鼠上、下呼吸 道均可以快速大量增殖。于PID 3鼻腔洗液病毒负 载量的均值达到1()4拷贝/ml ，随后下降，PID 20病 毒载量最低，但仍显著高于对照组G = 5. 72, P < 〇.()5)，后又开始增高，直到PID 4U 仍处于高峰；在 肺部，PID 3病毒载量均值达到1()7拷贝/g 组织，随 后开始下降，PID 10载量最低，但仍显著高于对照组 G = 4. 61，P <(U 15)，PID 2()至 PID 30 病毒载量上升，
PIW 0快速下降，但病毒未完全清除c
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图2人3型副流感病毒感染小鼠后在上、下呼吸道的增殖A 鼻
腔
B 肺
2.3感染小鼠肺组织病理变化的观察
选取不同感染时间点的小鼠肺做病理切片，由
图3可见，与对照小鼠相比，感染小鼠肺部出现明显 的炎症病变，包括肺泡和细支气管壁肿胀，肺泡和细 支气管内充血及分泌黏性物质，同时伴随着巨噬细 胞聚集等炎症病理反应，而且病理进程与病毒增殖 过程一致。
2. 4感染小鼠HPIV 3特异性IgA 、IgG A S C 的免疫应答
图3小鼠感染人3型副流感病毒不同时间后肺病理变化(4〇x ) A 对照 B 3d C l()d D 20d E 3()d F 40
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• 143 •
■■外周血 =肺
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10 d 20 d 30 d 40 d 感染时间组
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10 d 20 d 30 d 40 d 感染时间组
图5小鼠感染人3型副流感病毒后不同组织中病毒特异性T 细胞
应答 A IF N -yC W *T B IFN-y CD8+T
2.6感染小鼠血清中抗体免疫应答分析
用间接ELISA 对感染小鼠血清中IgG 、IgA 抗体 应答进行评价。由图6可见，病毒在小鼠体内诱导了 高滴度的IgG 抗体以及中等滴度的IgA 抗体，在小鼠 感染4(1 d 内，血清IgG 、IgA 抗体免疫应答逐步增强，至 PID 40均达到最高，感染组血清IgG 应答比对照组高
6抑賠(《 = 2.94，尸<0.05)，匕八应答比对照组高约16
倍(《=18.66，尸<0.05)，阳转率均为湖％。
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图6
人3型副流感病毒感染小鼠血清中IgG 、Ig A 抗体应答
IgG B IgA
—■外周血 =•肺
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注：ASC ：抗体分泌淋巴细胞
图■♦小鼠感染人3型副流感病毒后不同组织中病毒特异性IgA 、 IgG ASC 免疫应答 A IgA B IgG
2. 5感染小鼠HPIV 3特异性T 细胞应答
使用流式细胞术测定HPIV 3感染后小鼠肺、
脾和外周血淋巴细胞中H H V 3特异性IFN -7 CD 4+ T 、IFN -7CD «+ T 细胞应答。结果显示（图 5)，HPIV 3鼻腔感染小鼠后，可以显著诱导肺中 IFN -7 CD 8+ T 和IFN -7 CD 4+ T 细胞应答，且持续 的时间最长；而在脾(< =4. 44,P <0. ()5)和外周血中 (f = 4.86,P <0. 05)IFN -7 CD 8+ T 细胞应答显著 低于肺部。诱导的IFN -7CD 4+ T 细胞应答主要出 现在感染早期，且持续时间较短。
于感染后不同时间点提取小鼠肺、脾和外周血 淋巴细胞，用ELIspot 测定HPIV 3特异性A S C 应 答。结果表明（图4)，感染小鼠的肺、脾和外周血中 均产生HPIV 3特异性IgA A S C 应答，肺部应答出 现最早(PID 3可见)最强，均值14. 5/105淋巴细胞， 且持续时间最长(40 d )；脾其次(PID 3可见），PID 1() 达到最强，均值12. 8/105淋巴细胞；外周血应答最 慢,PID 20达到最高，均值8. 6/1U 5淋巴细胞，但持 续时间很短。HPIV 3特异性IgG A S C 应答在脾出 现最快（PID 3可见）最强，均值100. 0/105淋巴细 胞，持续时间最长(4(1 d )；其次是在肺(PID 3可见）; 外周血应答时间最迟，PID 20应答最高，但持续时间 很短。
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