高等植物的组织培养(tissue culture)技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。组织培养按培养对象可分为植株培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养等。我们所进行的试验是属于器官培养。 一、试验的技术流程
试验前期的准备：包括组培植物的准备，实验室仪器检查和药品核对，培养基的配制，外植体的无菌处理，无菌接种，培养箱内培养，培养架上培养，转培养基与扩繁，驯化与炼苗增加植物的抗逆性，室外移栽形成商品苗。
二、具体试验实施及其要解决问题
根据试验的设计特将试验分为三个阶段：
（一）、 沉水生植物无菌繁殖体系建立阶段：沉水植物沉水生植物无菌繁殖体系建立阶段是指从试验开始到培养出一定数量的无菌繁殖体。
本阶段主要试验技术要点包括：
1.培养基的配置与选择
2.外植体的消毒处理
3.诱导培养基、植株再生培养基、生根培养基的配制
4. 植物培养条件的选择
（二）、驯化炼移栽形成商品苗试验阶段：试管苗移栽是组织培养的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应该选择适用合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个工作有条不紊地进行。
在驯化和移栽过程中主要存在的技术难点包括：
1. 炼苗移栽的注意事项和营养液的配制和调整
2. 水体和土壤的各种理化指标对沉水植物生长的影响
（三）、工艺方法与流程的改进阶段
1.组培操作流程的简化和成本的消减
2.繁殖速度、成本和周期计算，最优组合的选择
BLK222
三、主要试验技术要点简介
（一）、 培养基的配制与选择
1.培养基的种类
培养基根据是否家凝固剂可以把培养基分为固体培养基和液体培养基，根据植物的品种不同培养器官不同进行试验选择。
目前国际上流行的培养基有几十种。常用的培养基及特点如下：
①.ＭＳ培养基 它是1962年由Ｍurashige和Ｓkoog为培养烟草细胞而设计的。 特点是无机
盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适， 可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其它培养基为高， 广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。
原水管
②．Ｂ5培养基 是1968年由ＧamBorg等为培养大豆根细胞而设计的。 其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在Ｂ5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。
③．Ｗhite培养基 是1943年由Ｗhite为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作Ｗhite改良培养基，提高了ＭgＳＯ4 的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。
④．Ｎ6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 其特点是成分较简单，ＫＮＯ3和（ＮＨ4）2ＳＯ4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养和其它组织培养。
⑤．ＫＭ－８Ｐ培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。 其特点是有机成分较复杂。它包括了所有的单糖和维生素。广泛用于原生质体和融合体的培养。
另外还有一些培养基就不再依次陈述。
2.培养基的配制：
培养液的配制包括母液的配制和培养液的配制：
培养基母液的配制和保存以MS培养基为例：MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。
•培养基配制程序如下：(水、药、糖、琼脂) →混合→PH调整→加热溶解→分装玻璃器皿→水洗→干燥→加棉塞高压蒸汽灭菌→冷却→凝固→接种。 （二）、外植体的消毒处理
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养 基，便会造成培养基污染。因此植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。
首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料 ，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗，浓度可按100ml 水加半角匙洗衣粉为宜，大约浸洗5分钟，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质－吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。它具有使植物材料表面被浸湿的作用。70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，也可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，
待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1～2 种使用。
表4－2 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
灭菌剂 | 塑料管电晕处理机使用浓度 | 持续时间(min) | 去除的难易 | 效果 |
次氯酸钙 | 9～10% | 5～30 | 易 | 很好 |
次氯酸钠 | 2% | 5～30 | 易 | 很好 |
| 0．1～1% | 5～8 | 桌卡制作较难 | 最好 |
抗菌素 | 4～50mg/L | 扑克记牌器30～60 | 中 | 较好headcall |
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上述灭菌剂应在使用前临时配制，可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生来杀菌，故灭菌时用广口瓶加盖较好；是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗3～4次即可；而用液灭菌的材料，因残毒较难去除，应当用无菌水涮洗8～10
次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒。
灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其它器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1～2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料， 宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中灭菌很多材料。
由于沉水植物植株生长在水中，所以杂菌、病毒很难别彻底去除，消毒也浓度过高或处理时间过长又容易使植株失去活性。因此再消毒液的品种选择组合以及消毒时间浓度都使比较难以把握的，需要进行大量试验摸索。
（三）、诱导培养基、植株再生培养基、生根培养基的配制
在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，先由一种已被广泛使用的基本培养基（如MS培养基或B5培养基）开始。当通过一系列的实验，对这种培养基做了
某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基。诱导培养基、植株再生培养基、生根培养基主要使通过调整培养基中的植物生长调节剂来诱导植物产生不同的分生组织。植物生长调节剂主要包括生长素、赤霉素和细胞分裂素。
1.植物生长调节剂 是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质， 对植物组织培养起着决定性作用。
①生长素类 在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。 在极低的浓度下，（１０－５～１０－８mg/L）就可促进生长。
天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。
