二甲基亚砜和四氢呋喃对胃蛋白酶催化动力学和分子光谱的影响 黎春怡;黄卓烈;李利佳;巫光宏;何平;朱国辉
【摘 要】为了研究二甲基亚砜(DMSO)和四氢呋喃(THF)对胃蛋白酶(Pepsin,PP)催化活性的影响及其作用本质,测定了在这两种有机溶剂的作用下胃蛋白酶的催化活性、动力学参数、紫外吸收光谱、紫外差示光谱和荧光发射光谱的变化.结果表明,体积分数为9％的DMSO使PP活性提高83.4％；而体积分数为1％的THF只能使PP活性提高3.59％.在盐酸溶液中,PP的动力学参数Km=2.22 mg/mL,vmax=1.1×106 U/mg Pro;在9％ DMSO中,其Km=1.50 mg/mL,vmax=0.5×106 U/mg Pro;在1％THF中的Km=1.91 mg/mL,vmax=0.51×106 U/mg Pro.9％ DMSO强烈抑制PP分子肽键的紫外吸收,而对芳香族氨基酸无影响；1％THF则对PP的紫外吸收光谱影响不大.9％ DMSO和1％ THF都使PP的紫外差示光谱出现明显的负吸收峰和正吸收峰.9％ DMSO使酶分子的荧光发射峰向短波方向移动1 nm；而1％THF则对其无影响.实验结果表明,在9％DMSO和1％THF中,PP分子的立体构象发生了变化,使酶分子的Km下降,酶分子对底物的亲和力有所升高,从而导致酶分子的催化活性有不同程度的提高.%In order to approach the effects and action mechanism of dimethyl sulfoxide (DMSO) and tetrahydro furan(THF) on pepsin, the catalytic activity, kinetics parameters, ultraviolet absorption spectra, ultraviolet differential spectra, and fluorescence emission spectra of pepsin were investigated. It was indicated that pepsin activity was enhanced by 83. 4% as the enzyme was treated with 9% DMSO. But when pepsin was treated with 1%THF the enzyme activity was enhanced only by 3. 59%. In hydrochloric acid solution the kinetics parameter of the enzyme, Km = 2. 22 mg/mL, vmax = 1. 1×106 U/mg Pro. In 9% DMSO, Km = 1. 50 mg/mL, vmax=0.5×l06U/mgPro. In 1%THF, Km = 1. 91 mg/mL and vmax=0. 51 ×l06 U/mg Pro. In 9%DMSO the ultraviolet absorption of pepsin peptide bonds was strongly inhibited. But the ultraviolet absorption of aromatic amino acids of pepsin was not inhibited. The ultraviolet absorption of pepsin molecules was not influenced obviously in 1%THF. Both in 9% DMSO and in 1%THF the ultraviolet differential spectra of pepsin showed obvious positive and negative peaks. The fluorescence emission peak of pepsin enzyme moved to short wavelength direction by 1 run in 9% DMSO. But in 1 % THF the fluorescence emission spectrum did not change obviously. It was concluded from these results that the conformation of pepsin molecules changed obviously in both 9% DMSO a
nd 1%THF. This led the Km value of the enzyme descended and the affinity of the enzyme to substrates enhanced. So the catalysis activities of the enzyme were increased in some extent in these solutions.
【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】2012(033)005
【总页数】8页(P988-995)
【关键词】胃蛋白酶;二甲基亚砜;四氢呋喃;动力学;光谱
【作 者】黎春怡;黄卓烈;李利佳;巫光宏;何平;朱国辉
【作者单位】华南农业大学生命科学学院,广州510642;茂名职业技术学院,茂名525000;华南农业大学生命科学学院,广州510642;华南农业大学生命科学学院,广州510642;华南农业大学生命科学学院,广州510642;华南农业大学生命科学学院,广州510642;华南农业大学生命科学学院,广州510642
【正文语种】中 文棉籽皮
【中图分类】O629;Q556
胃蛋白酶（Pepsin，PP）是一种单链酶，分子量约为35500.在pH=1.5～5.0条件下，细胞合成的胃蛋白酶原裂解变成小分子的胃蛋白酶.PP在胃中酸性很强的环境下消化蛋白质，促使苯丙氨酸、酪氨酸、氨酸、亮氨酸、谷氨酸以及谷氨酰胺等氨基酸形成的肽键断裂，使大分子的蛋白质变为较小分子的多肽.在pH=2时，PP优先作用于天然蛋白质，pH=4时能消化某些特异性的肽，pH超过6时失去活性.在体外，PP的持续作用可使蛋白质分子中约30%的肽键分裂，形成脙、胨和一些氨基酸，而且一部分被分解为酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸.PP不作用于角蛋白和粘蛋白，亦不作用于低分子量的蛋白衍生物.在复合维生素与蛋白质的结合和释放上，PP亦起主要作用.
传统的观点认为，酶作为一种高效的催化剂只在水溶液中才可发挥催化作用，在有机溶剂中会发生构型变化而失活，这极大地限制了酶在工业上的应用.20世纪60年代，人们发现来自生物体的几种酶在有机溶剂中仍有活性［1，2］;Zaks等［3］发现某些酶在近乎无水的环境下仍有催化活性，并且酶的稳定性还有所提高;Ru等［4，5］和Yang等［6］对枯草杆
菌蛋白酶的研究发现，有机溶剂能极大地增强该酶的活性;Klibanov［7］报道，在有机溶剂存在的情况下，部分酶的催化活性有较大的改善;Doukyu等［8］发现有些酶能强烈忍受有机溶剂对其分子结构的影响，在较大浓度的有机溶剂存在下仍表现出较高的催化活性;Serebryakova等［9］报道了水溶性有机溶剂存在时能有效地提高氢化酶的活性;Serdakowski等［10］发现不同的有机溶剂对不同酶激活的程度有较大的差别;Szabo等［11］发现经化学修饰的木瓜蛋白酶的分子稳定性和催化活性在水溶性有机溶剂中均得到较大的改善.
有机溶剂主要通过对体系中水、酶以及底物和产物的作用来间接或直接影响酶活性.李秀文等［12］认为有机溶剂可以用3种方式来影响酶促反应:第一种方式是有机溶剂可能与酶直接发生作用，干扰酶分子的氢键和疏水键，改变酶分子的空间结构，从而导致酶催化活性的改变;第二种方式是有机溶剂可能与扩散的底物或反应产物发生相互作用，从而影响反应的速度;第三种方式是有机溶剂可能直接与酶分子周围的水发生相互作用.一般认为，在非水相反应体系中，添加亲水性或水互溶性的有机溶剂对酶的催化活性不利，因为它们会夺去酶表面微环境中的水而使其失活.
尽管关于有机溶剂对酶促反应影响的研究非常活跃，但迄今仍处于实验阶段，离工业生产大规模应用还有一定的距离，其主要原因之一是多数酶在有机溶剂中活性并不高.有机溶剂中酶的活性通常要比水溶液中低2～6个数量级.因此，确定有机溶剂中酶活性的影响因素，提高有机溶剂中酶活性成为当今酶学研究的重要课题.
桥梁同步顶升目前，关于有机溶剂对PP的催化作用影响的研究尚未见报道.本文利用二甲基亚砜（DMSO）和四氢呋喃（THF）为效应物，研究了PP在这两个体系中的催化活性变化及催化动力学;并通过研究PP在DMSO和THF作用下的紫外吸收光谱、紫外差示光谱及荧光发射光谱的变化，探索这两种有机溶剂对酶分子结构和催化活性影响的作用本质.
1.1 试剂与仪器
胃蛋白酶购于Sanland化学试剂有限公司，纯酶由此胃蛋白酶纯化提取而得;商品胃蛋白酶纯酶、酪蛋白及牛血清白蛋白购于美国Sigma公司;考马斯亮蓝G250和R250均购于Fluka公司;其余试剂为国产分析纯试剂.
UV240pc紫外-可见分光光度计（日本岛津）;F4500型荧光分光光度计（日本日立）;DYY-5稳压稳流电泳仪（北京六一厂）;凝胶成像系统（珠海黑马）.
1.2 实验方法
1.2.1 PP溶液的制备将PP用0.065 mol/L HCl溶解并配制成1 mg/mL的溶液.蛋白质含量参照Bradford方法［13］测定.PP活性的测定参考中国药典（2000）方法，并作适当的修改，以酪蛋白为底物.酶促反应后，在275 nm测定所生成酪氨酸的吸光值.酪氨酸标准吸光度（As）的测定:精密称取酪氨酸适量，溶于0.065 mol/L HCl配制成0.5 mg/mL标准酪氨酸溶液，在275 nm测得其As=0.440.
PP活性单位的定义:在pH=1.5和37℃条件下，每毫克蛋白质水解酪蛋白每分钟产生1 μg酪氨酸为1个PP活性单位（U/mg）.
1.2.2 有机溶剂中PP的活性测定以0.065 mol/L HCl分别配制不同体积分数的DMSO溶液和THF溶液，PP在DMSO和THF溶液中的活性测定参照其在水溶液中的方法进行.
1.2.3 PP的纯化参考文献［14，15］方法进行.PP粗酶液经Sephadex G-100层析分离纯化，柱子预先用pH=3.6的0.05 mol/L NaAc-HAc缓冲液平衡，柱床体积2 cm×50 cm，加样量为3 mL，用自动部分收集器收集，4 mL/管.测定各管收集液的A280nm及其酶活性.
1.2.4 PP纯度鉴定通过垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定经纯化PP的纯度.浓缩胶质量分数为5%，分离胶质量分数为7.5%，点样量为15 μL/孔.样品在浓缩胶时电压为100 V，进入分离胶后电压为200 V.电泳后用考马斯亮蓝R-250染30 min后脱，然后检验酶的纯度，并用黑马凝胶成像系统拍照.
1.2.5 PP动力学测定蛋白酶可采用酪蛋白为底物测定动力学［16～21］.在37℃和pH=1.5条件下分别测定了PP在0.065 mol/L HCl，DMSO及THF中的催化动力学，用双倒数作图法分别求出Km值和vmax值.
捕虾机电路图1.2.6 光谱分析以相应的溶剂作为空白，分别测定了PP在0.065 mol/L HCl，9%DMSO和1%THF中的紫外吸收光谱、紫外差示光谱以及荧光发射光谱.
2.1 胃蛋白酶的纯化及纯度鉴定
PP粗酶液经Sephadex G-100分离纯化，检测蛋白质含量（A280nm）和酶活性，得到3个蛋白峰，其中最高酶活性峰与第2个蛋白峰重叠（图1），与第3个蛋白峰重叠的有1个很小的酶活性峰.收集第2个酶活性峰液，此活性峰酶的比活性比粗酶提高了2.67倍.
将纯化后酶比活性最高的一管酶液浓缩后进行PAGE鉴定，电泳图见图2.可见，纯化后的PP仅剩余一条与商品纯酶迁移率相同的电泳带，说明该酶的纯度已达到电泳纯，可用于DMSO和THF对PP活性影响的验证实验、动力学及光谱学研究.
2.2 不同浓度的有机溶剂对胃蛋白酶催化活性的影响
以0.065 mol/L HCl中的PP活性作为对照（即0%）测定了不同浓度DMSO和THF对PP活性的影响.图3（A）是用未经纯化的PP的实验结果，可见DMSO和THF对PP均表现出激活作用，但激活程度有所不同.在DMSO中，PP活性表现为中、低浓度被激活，高浓度时被抑制;DMSO对PP的最大激活浓度为9%，此时酶活性比对照提高了83.4%;当浓度高于9%，随着DMSO浓度的增大PP活性升高的幅度降低;当浓度大于22%后，DMSO开始表现出对PP的抑制作用.极低浓度的THF对PP有轻微激活作用，1%THF对PP的激活程度最大，但酶活性比对照只增加3.59%，几乎可以忽略;当THF浓度大于3%后，PP活性开始被抑制;浓度为16%时，PP活性只为对照的17.0%;浓度达到41.7%时，酶完全丧失活性.图3（B）是提纯后PP的实验结果，可见不同浓度DMSO和THF对酶活性影响的规律与图3（A）的规律基本一致，只是纯酶的比活性比粗酶要高得多.
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酶在有机溶剂中的结构和活性与溶剂的性质有一定相关性.DMSO，THF和水的极性大小顺序为水＞DMSO＞THF.纯水中加入有机溶剂会使体系的极性降低，有机溶剂的极性越小，体系极性降低的程度越大;体系中有机溶剂的浓度越大，极性的降低程度也越大.极性降低使水系统局部能量降低，有利于水集团的拆散，使单体水分子数目增加，从而有利于蛋白质对水分子的结合，使酶分子因表面吸附的水分子数量增多而柔性增大，导致酶与底物间形成过渡态的能阈更小，最终使酶活性升高.
然而，水溶性酶的带电基团与极性基团通常分布在分子表面，非极性疏水基团包埋于内部，在极性很强的水溶液中处于热力学稳定状态（即能量最低状态）.由于热运动，酶分子在水溶液中的构象处于一种动态变化中，可能使内部的非极性疏水基团翻到表面.但是，疏水基团翻出作用是一种热力学非自发过程，需要很高的活化能，通常几率很小.有机溶剂的加入可使溶液极性降低，导致蛋白质体系的稳定性降低，疏水基团翻到表面所需的活化能减小，翻出几率就会增大［22］，使酶分子的构象发生较大的改变，从而使酶活性降低.
