在体外试验中白术内酯I修复HO-I表达和抑制OX-LDL诱导的VSMCs增殖, 迁移和炎症反应
动脉粥样硬化的发病机理是以血管平滑肌细胞(VSMCs )的增殖和迁移以及炎 症斑块为特征。这篇文章的目的是，阐明白术内酯I通过氧化修复低密度脂蛋 白(OX-LDL )诱导血管平滑肌细胞炎症作用，增殖和迁移的作用。这里，我们 发觉白术内酯I以剂量依靠的方式抑制OxLDL诱导的VSMCs增殖和迁移,并 且在VSMCs中削减炎性细胞因子的产生和单核趋化蛋白1 ( MCP-I)的表达。 这项争论也显示出AO-I显著的抑制p38-MAPK和NF-κB活性。更重要的是, 在o×LDL诱导的VSMCs中，特异性的亚铁血红素氧化酶1 ( HO-I)抑制剂 锌原吓琳(ZnPP ) IX部分的消退白术内酯I的有益作用。此外，白术内酯I在 OXLDL诱导的巨噬细胞中阻断泡沫细胞的形成。总之，在VSMCS增殖和迁移 中AO-I升降机构
的抑制作用，脂质过氧化反应和随后的炎症反应可能有助于AO-I的抗 动脉粥样硬化的特性。 动脉粥样硬化是一个伴随血管损伤过程的炎症性病变，通过以往的争论进 行了探究和争论［1,2］。有一些证据表明炎症是动脉粥样硬化疾病发生和进展的 关键因素之一。在动脉粥样硬化早期，各种刺激因子诱导动脉壁脂质积累，导 致炎症介质释放、细胞粘附、脂质斑块生成、平滑肌增生和迁移［3］。氧化修饰 低密度脂蛋白(OX-LDL )通过促进纤维物质的分泌，
促进血管平滑肌细胞增殖 和迁移，增加炎症反应,增加纤维斑块［4 ］o OX-LDL诱导的VSMC增殖和迁 移的抑制是动脉粥样硬化的潜在的靶点［5,6］。此外，巨噬细胞与动脉 粥样硬化病变的血管炎症反应有关［7 ］β针对动脉粥样硬化的简单性，有必要 研讨动脉粥样硬化形成的机制，查动脉粥样硬化的新的药用成分。
在动脉粥样硬化的病理过程，肿瘤坏死因子-α (TNF-C()［ 8 ］,白细胞介 素(IL-6 ) ［ 按摩毯9 ］和一氧化氮(NO ) ［10］ z介导一系列急性炎症反应［11］。大量 NO的产生可导致iN0S的过度表达,导致低密度脂蛋白的氧化［12 这些炎 症因子在动脉损伤过程中的上调，间接促进血管平滑肌细胞的迁移和增殖，加 速动脉粥样硬化的病理变化。以前的争论也表明这些因素通过激活丝裂原活化 蛋白激酶(MAPK )玻璃钢蓄水池和核因子κB ( NF-κB )信号转导通路的［13-15］促使动脉 粥样硬化形成。
单核细胞趋化蛋白-1 ( MCP-I)对单核细胞高亲和力和可以在巨噬细胞、 内皮细胞和血管肌细胞中表达，这些细胞由多种炎症因子引起的，如白细胞介 素、肿瘤坏死因子干扰素Y。争论表明，MCP∙1促进单核细胞转化为巨噬
细颗口泡沫细胞的形成［16 ］o同时，活化的血管细胞能释放大量的生长因子, 促进血管平
滑肌细胞的增殖和迁移［17 动脉粥样硬化斑块中核转录因子调整 MCP-I表达的转录［18 ］β
血红素加氧酶-1 （ HO-I）作为一种原始的和限速酶在血红素降解中生成 胆绿素、一氧化碳和铁，抗氧化、抗炎、细胞凋亡的抑制、改善微循环中发挥 重要的作用［19,20］。争论表明，HO-I调整血管平滑肌细胞的迁移、增殖和凋 亡，此外,它维持血管系统的稳定［21,22］。此外，在HUVECs中OX-LDL通过 Nrf2∕H0-l通路诱导MCP-I的表达［23 ］o锌原吓琳（ZnPP ） IX作为HO-I 的抑制剂［24 ］o
白术内酯K AO-D （化学结构如图1所示）作为一种从白术中提取的主 要生物活性成分，已被用于炎症性疾病［25,26］。AO-I对LPS诱导的急性 肺损伤具有显著的爱护作用［27 ］o AO-I已被发觉能抑制小鼠气囊模型和小鼠 主动脉环和腹腔巨噬细胞共培育模型的血管生成的抑制慢性炎症。通过LPS诱 导巨噬细胞中，AO-I也降低TNF-Ot和NO的产生［29 ］o此外，AO-I也指出 其他一些生物活性如抗过敏反应［30 ］,在人白血病HL-60细胞的增殖［31,32］ 中细胞毒活性和抗癌活性［33 ］o依据此前的报道,我们推想,AO-I可能经过 炎症反应伴随的病理过程动脉粥样硬化。为了描述AO-I的抗动脉粥样硬 化的作
用，我们测量氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞迁移和增殖，在 RAW 264.7巨噬细胞中削减泡沫细胞的形成和上清液中TNF-a、IL-6、N0, 与MCP-I的水平。为了进一步争论AO-I点头娃娃抗动脉粥样硬化的机制，对MAPK , NF-KB信号通路和HO-I的表达进行了争论。因此，本争论的目的是确定AO- I在抗动脉粥样硬化的潜在作用，并供应一个AO-I的药理作用的分子机制。
2.材料和方法
2.1.料和试剂
白术内酯钢丝生产I （ AO-I）是由Dalian melonepharma有限公司供应（大连， 中国）。高氧化低密度脂蛋白（90 nmol MDA / mg蛋白）购自Yiyuan Biotechnologies （广州，中国）。乙二胺四乙酸（EDTA ）和二甲基亚硼 （DMSO ）从Sigma （ sigma化学公司，圣路易斯，穆村，美国）获得。锌原 口卜琳 IX、SB203580s SP600125 , U0126 和 Bcap37 购自 Sigma （圣路易斯， 穆村，美国）。DMEM和RPMI-1640自购自Gibco （ GIBCO-BRL z盖瑟斯 堡，MD ,美国）。大鼠TNF , IL-6和MCP-I的酶联免疫吸附试验（ELISA ） 试剂盒是从R&D系统（明尼阿波利斯，MN ,美国）购买的。多克隆抗体抗
PP38、P38、pJNK f pJNK z ERKl / 2 f ERKl / 2 NF-κB p65 Jλ R&D 统选购（明尼阿波利斯、MN、美国）。多克隆抗体抗HO-I和PCNA购自 Stressgen （安娜堡，米河）。抗3磷酸甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH ）抗体从 生物圣克鲁斯公司购买（圣克鲁斯，CA ,美国）。聚偏氟二烯（PVDF ）膜从 PaIlGelman试验室购买（安娜堡、米河、美国购买）。其他试剂均为市售分 析级。
22细胞培育和
从胸主动脉中平滑肌细胞进行培育。雄性SD大鼠（100-120 g ）与水合 氯醛麻醉。胸主动脉进行分别，同时去除粘合剂脂肪和问题。简而言之，对血 管内膜的内皮细胞层被去除。主动脉动脉切成约1毫米的片段，并放置在一个 37℃ DMEM高糖培育基含有10%热灭活胎牛血清的细胞培育容器（FBS）, 然后移转移到95%的空气和5%的CO2的箱中。当细胞达到90%汇合时就可 以进行试验了。细胞（通道3-8 ）通过免疫组化染平滑肌肌动蛋白对他们的 whilland-valleyw外观鉴定（博士德、武汉、中国）。
7天腹腔注射1%筑基乙酸钠后,从雌性昆明种小鼠（20-25g ）腹腔的分 泌细胞中分别巨噬细胞。第七天将小鼠使用CO2处死后，用5毫升磷酸盐缓冲 生理盐水灌洗液，离心5分钟。
收集的细胞用磷酸盐缓冲盐水洗三次，然后悬 浮培育于含10%胎牛血清的培育基中。在37℃培育箱中,空气95% ,二氧化 碳5%o AO-I, OX-LDL中培育和在二甲基亚飒（DMSO ）中溶解和在DMEM 培育液进一步稀释。DMSO终浓度小于0.5%。
2.3.TNF-α, IL-6 和 No 的测定
收集细胞上清液评价在VSMCs的培育中，AO-I对于TNF-α , IL-6和NO 产生的作用。VSMCs分别接种到24孔培育板的密度为IXlo4细胞/孔，在含 10%胎牛血清的DMEM培育基中37。C孵育24 ho细胞达到80%汇合后,在 无血清培育基中孵育24小时。然后细胞预先用不同浓度的AO-I处理24小时 后，细胞用OX-LDL刺激24 h , 4。C离心10分钟得到的上清液，它们被存储在 -80℃ z用于TNF-a、IL-6和NO的定量。TNF-a和IL-6的测定分别采纳市 售的ELISA试剂盒，依据制造商的说明进行。用GrieSS反应定量分析NO。酶 联免疫吸附法测定OX-LDL诱导的TNF-a和IL-6的动力学。全部细节的处理 均在图例中表示。
在VSMCs中，收集细胞上清中估量AO-I对于MCP-I的影响（作为一个 重要的趋化因子）。将细胞接种到24孔培育板的密度为IXlo4细胞/孔，24 h 在37℃下孵育。然后预处理细胞与不同浓度的AO-I处理24 h或无抑制剂 （SB203580作为p38抑制剂、JNK抑制剂为SP6001
25 ,如ERK抑制剂为 U0126 , BAY11-7082作为NF-κB抑制剂），接着与OX-LDL诱导刺激24 h , 然后4。C通过离心分别10分钟。MCP-I测定使用市售的EUSA试剂盒,依据 制造商的指示。全部的细节处理均在图例中表示。
2.5.VSMCs增殖试验
用MTT法测定细胞活性和OX-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖状况,如前 所述［34 ］o简而言之，血清饥饿VSMCs通过AO-I的指定浓度预处理1 h , 然后用OX-LDL处理24ho在MTT添加过后，紫甲瓒晶体溶解在DMSO中 并且用540nm吸光度测定。按对比组的百分比计算细胞活性和增殖率（未处 理 VSMCS）
2.6.VSMCs迁移试验
Ox-LDL介导的VSMC迁移是通过2种方法确定：划痕法和Boyden小室 法检测［35 对于伤口愈合试验，VSMCs被播种在12孔板（每孔IXlo5细
胞）和生长汇合。将饥饿的单层细胞安装在可重复使用的模板上，形成标准的 无菌切口 ,然后用温PBS冲洗。然后将细胞与AO-I （ 12.5,25或50μm ）孵 育1小时，通过有无OX-L
DL（IOOμg∕ml）刺激24小时。创面愈合率通过荧 光显微镜直接观看（徒卡DM IRB ;韦茨拉尔、德国）。该程序允许在O小时, 12 h和24 h拍摄的相同点。迁移距离用Scion Image软件分析。
改良的Boyden小室法，通过24孔Boyden小室含纤连蛋白涂层的聚碳 酸酯膜的评估（8μm孑准、BD生物科学，美国）。简而言之，就是细胞在含 0.1%牛血清白蛋白的无血清培育基中，以密度为2000接种在室的上孔，然后 迁移到含有或无IOO μg∕mL ox-LDL的无血清培育基中，随着AO-I如图表明 迁移。5小时后，当细胞粘附下表面时，非迁移的细胞附着膜的上表面，放在 载玻片上固定于10%福尔马林中并用Hoechst33342染。通过在显微镜下 计算五个随机选择的区域，测定每孔细胞迁移通过膜的数量（×200 ）。
2.7.免疫印迹分析
在 OX-LDL 诱导的 VSMCS 中 HO-I , PCNA , MAPKs 和 NF-κB p65 蛋白 的表达激活，用Western blot检测依据以前的争论［36 ］o收集细胞裂解液和 蛋白浓度通过BCA蛋白试验测定（Applygen科技有限公司，北京，中国）。 用10% SDS-PAGE分别蛋白（50 μg）,转移到硝酸纤维素膜上。在TTBS中 室温下膜封闭用5%脱脂奶粉2小时，4℃一抗体过夜如
下：HO-I洗衣机模具x PCNA （在TBST中1:500稀释），总p38 ,磷酸化38 ,总细胞外信号调整蛋白激酶 （ERKl/2）,磷酸化ERKl / 2 ,总应力活化蛋白激酶c-jun-氨基末端激酶 （JNK）,磷酸化 JNK 和 NF-κB p65 （在 TBSTl:200 稀释）和 GAPDH （在 TBSTl:500稀释）。用TBST扩大洗膜后,用1:5000稀释辣根过氧化物酶标 记的二抗孵育（NEB , MA ,美国）。蛋白质检测是用化学发光系统和用 GraphPad Prism 5.01量化（加利福尼亚，美国）。
