华中科技大学
博士学位论文
姓名：***亚太牌自动粉墙机
申请学位级别：博士
专业：免疫学
指导教师：***
2009-11
摘要
背景
程序性死亡受体-1(programmed death 1, PD-1)是CD28家族中的成员。活化的T 细胞与B细胞表达PD-1。 PD-1通过与程序性死亡受体配体1(programmed death ligand 1, PDL1)或程序性死亡受体配体2(programmed death ligand 2, PDL2)结合，传递抑制性协同刺激信号。T 细胞与B细胞在类风湿关节炎发病中起重要作用。作为一个重要的T细胞与B细胞活化的负性调节分子，PD-1可能是一个类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的靶点。
mPDL1-hIg是由小鼠PDL1胞外段与人IgGFc组成的融合蛋白，具有小鼠PDL1的生物活性。由于mPDL1-hIg含有人IgGFc，因而mPDL1-hIg能比较容易地检测及纯化。而且，mPDL1-hIg中人IgGFc理论上可延长mPDL1-hIg中小鼠PDL1胞外段的半衰期，有利于mPDL1-hIg中小鼠PDL1胞外段在体内发挥效应。 II胶原诱导关节炎（Collagen II -induced arthritis, CIA）是广泛用来研究人类风湿关节炎发病机制的实验关节炎模型。
目的
在成功构建mPDL1-hIg基因真核表达载体、进而获得稳定表达mPDL1-hIg 的CHO细胞株，从而获得mPDL1-hIg的基础上，探讨mPDL1-hIg对CIA的效应，为探索RA提供新思维、新方法以及实验依据。
方法
①活化的正常小鼠去红细胞的脾细胞与mPDL1-hIg相互作用后，再与荧光素标记的抗人IgG二抗作用，流式细胞术检测活化的正常小鼠去红细胞的脾细胞与mPDL1-hIg的结合率。
②小牛II型胶原2次免疫的小鼠去红细胞的脾细胞经过CFSE染后，再用变性小牛II型胶原刺激。流式细胞术检测mPDL1-hIg对变性小牛II型胶原刺激的细胞增殖的影响，ELISA法检测mPDL1-hIg对变性小牛II型胶原刺激的细胞表达IL-17与IL-23的影响。 ③小牛II型胶原2次免疫小鼠诱导CIA，并将小牛II型胶原免疫小鼠随机分成2组：实验组与对照组，实验组小鼠用mPDL1-hIg，对照组小鼠用人IgG。从第0天起，每天观测小鼠（第二次免疫的时间确定为第0天）。
④在第九天，取mPDL1-hIg的CIA小鼠和人IgG的CIA小鼠的血清，ELISA法检测血清中IL-17与IL-23的表达。
⑤在第九天，取血清后，用颈椎脱位法处死mPDL1-hIg的CIA小鼠和人IgG 的CIA小鼠，然后迅速剪取脚爪组织，快速置入10％福尔马林溶液，固定脚爪组织；接着将固定好的脚爪组织移入10% EDTA溶液中脱钙；脱钙完成后冲洗、脱水、包埋成蜡块，最后切片及HE染。
⑥mPDL1-hIg的和人IgG的CIA小鼠的去红细胞的脾细胞经过CFSE 染后，再用变性小牛II
型胶原刺激，流式细胞术检测mPDL1-hIg对变性小牛II型胶原刺激的CIA小鼠去红细胞的脾细胞增殖的影响，ELISA法检测mPDL1-hIg对变性小牛II型胶原刺激的CIA小鼠去红细胞的脾细胞表达IL-17与IL-23的影响。
⑦全部数据采用平均数±标准差表示，两组数据间差异显著性检测采用U检验。用SPSS13.0统计分析软件处理数据，p＜0.05有显著性差异。
结果
①流式细胞术检测结果显示：mPDL1-hIg可与活化的正常小鼠去红细胞的脾细胞结合；在我们实验条件下，结合率约为43.62%。
冷气机组②流式细胞术证明：mPDL1-hIg可抑制变性小牛II型胶原刺激的来源于小牛II 型胶原免疫小鼠的去红细胞的脾细胞增殖；ELISA检测结果表明：mPDL1-hIg 可抑制变性小牛II型胶原刺激的来源于小牛II型胶原免疫小鼠的去红细胞的脾细胞表达IL-17与IL-23。
③mPDL1-hIg可显著降低小牛II型胶原免疫小鼠的的临床评分，尽管发病率没有受到影响（实验组与对照组的发病率都是6/7(86%)）。来源于mPDL1-hIg 小鼠和人IgG小鼠的脚爪组织切片HE染后显示，mPDL1-hIg可减轻关节病理改变。这些结果证明，mPDL1-hIg可抑制CIA加重，提示：PD-1-PDL途径涉及CIA的病理机制。
70sec
④ELISA检测结果表明：mPDL1-hIg可下调CIA小鼠血清中IL-17与IL-23的表达。
⑤流式细胞术证明：mPDL1-hIg能够抑制变性小牛II型胶原刺激的CIA小鼠去红细胞的脾细胞增殖。ELISA检测结果表明：mPDL1-hIg能够抑制变性小牛II型胶原刺激的CIA小鼠去红细胞的脾细胞表达IL-17与IL-23。这些结果提示：mPDL1-hIg通过抑制细胞增殖及IL-17与IL-23的表达而改善CIA。结论
mPDL1-hIg可显著改善CIA，表现在降低临床评分、减轻关节病理改变及下调血清中IL-17与IL-23的表达。mPDL1-hIg可通过抑制细胞增殖及IL-17与IL-23的表达而减轻CIA。
关键词：mPDL1-hIg, CIA, 细胞增殖, IL-17, IL-23
Abstract
Background
Programmed death 1(PD-1) is a CD28 family member. Activated T cells and B cell express PD-1. PD-1 delivers a coinhibitory signal upon binding to either of its two ligands, programmed death ligand 1 (PDL1) or programmed death ligand 2(PDL2).T cells and B cells play important roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis(RA). As an important negative regulator of the activation of T cel
ls and B cell, PD-1 might be the target for the treatment of RA.
mPDL1-hIg was the fusion protein composed of the extracellular domain of mouse PDL1 and hum an IgGFc and had biological effects of mouse PDL1. mPDL1-hIg could be easily detected and purified because it included hum an IgGFc. Moreover, hum an IgGFc of mPDL1-hIg might theoretically extend the half-live of mPDL1 of mPDL1-hIg, which could contribute to the effects of mPDL1 of mPDL1-hIg in vivo.
Collagen II (CII)-induced arthritis (CIA) is an experimental model of arthritis that has been used to dissect the pathogenesis of human RA.铝方通吊顶工艺
Objective
To investigate the effects of mPDL1-hIg on CIA on the basis of successful construction of the vector expressing mPDL1-hIg and the obtainment of the cell strain stabily expressing mPDL1-hIg and mPDL1-hIg, which would provide new idea, new method and experimental evidence for the exploration of the treatment of RA. Methods
①After activated erythrocyte-depleted splenocytes from normal mice interacted with mPDL1-hIg, the
y interacted with fluorescence labelling anti-human IgG antibody again. Flow cytometry detected the binding rate of activated erythrocyte-depleted splenocytes from normal mice and mPDL1-hIg.
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