孙汉青;陶红霞;宋雪娜;郭延平;赵政阳
【摘 要】为了研究在适度干旱条件下,苹果果实中海藻糖和脱落酸对果实品质提升所起的生理作用.以7～8 a生的盆栽嘎啦Gala/M26苹果树为试材,采用高效液相谱法和酶学测定法,测定不同程度干旱胁迫(田间最大持水量的75％～80％、60％～65％、50％～55％)和果心注射脱落酸(ABA)[0(蒸馏水)和1 mmol/L]的果实的果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇和海藻糖质量分数,内源ABA质量分数,海藻糖代谢相关酶[6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)和海藻糖酶(TRE)]活性.结果显示,干旱处理和ABA处理均使果实内源ABA质量分数增加,有利于果实内糖分的积累,促进TPS和TPP活性,但抑制海藻糖酶的活性.适度干旱条件下所产生的ABA影响海藻糖代谢途径的改变,促进海藻糖的积累,有利于果实中糖分的积累,提升果实品质. 【期刊名称】《西北农业学报》
【年(卷),期】2019(028)002
【总页数】9页(P204-212)
【关键词】干旱胁迫;外源ABA;糖分积累;海藻糖代谢
【作 者】孙汉青;陶红霞;宋雪娜;郭延平;赵政阳
【作者单位】西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100
【正文语种】中 文环境模拟舱
【中图分类】S661.1
干旱是影响农业生产的重要环境因子之一。在中国西北地区，由于水资源缺乏，春旱、伏旱现象严重，会影响苹果树的正常生长发育，导致果实品质下降。有研究发现，适度干旱能够导致碳水化合物质量分数增加，但其与碳信号之间的相互作用关系仍然不清楚[1]。
苹果果实中含有的糖类主要是淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖和少量的山梨醇，其中除淀粉外
均为可溶性糖，可溶性糖中以果糖最甜。果实风味及品质会受到果实总糖水平及果糖与葡萄糖的比值(F/G)的影响[2]。在苹果等蔷薇科植物中，山梨醇是光合产物运输的主要形式[3]，苹果韧皮部中，转运过程中的碳水化合物中山梨醇占80%[4]，起着其他植物中蔗糖的作用。
海藻糖(α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-glucopyranoside)是由2个葡萄糖分子组成的双糖，是一种安全、可靠的天然糖类，为非还原性糖，是糖类物质中性质最稳定的双糖之一[5]。海藻糖代谢途径包括：尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和6-磷酸葡萄糖(G-6-P)在6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)的作用下生成6-磷酸海藻糖(T6P)，T6P在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)的作用下生成海藻糖，海藻糖在海藻糖酶(TRE)的作用下分解为葡萄糖[6]。海藻糖有调节生物合成的功能，因为海藻糖可以修饰蛋白激酶，与14-3-3蛋白相互作用，从而参与它们的信号分子功能[7]。也有研究表明，海藻糖前体T6P在植物生长发育中被作为一个重要的信号分子可以影响植物生长及对碳的利用，在糖代谢过程中起重要的调节作用[8]。T6P与蔗糖非酵解蛋白激酶1(SnRK1)能协同调节植物的生长与发育[9]，当碳源缺乏时，植物体内T6P质量分数会减少，随后SnRK1活性增加，进而降低植物碳源消耗，增加碳同化进程和光合作用，最终使植物体内积累大量碳水化合物[10]。SnRK1是蔗糖非发酵(sucrose non-fermenti
ng,SNF)相关的腺苷-磷酸蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]家族中的一员，是调控细胞响应内源能量及碳状态的中枢[11]，在T6P抑制SnRK1活性后，会进而影响bZIP11启动子调控相关基因表达[12]。bZIP在植物发育和代谢过程中起关键性调控作用，主要功能是调节基因表达的强度，或应答外源激素和环境的胁迫[如参与植物对脱落酸(ABA)、光等发育中各种信号的反应][13]。植物遭遇盐、干旱或低温等非生物胁迫时，会产生ABA同时激活ABA依赖途径和ABA非依赖途径2种信号传导通路[14]，参与ABA依赖途径的基因不仅诱导ABA的生物合成，而且调节含有ABA响应元件(ABRE元件)的基因的表达。bZIP转录因子家族中的A亚族可以与ABRE元件结合[13]。
簇绒机为了探讨在适度干旱条件下，苹果果实品质的提升与海藻糖及ABA在糖代谢途径中的共同调节作用关系。本试验主要研究在适度水分胁迫下，苹果果实风味及品质发生改变的过程中，海藻糖与ABA在其中的作用，为探究适度干旱条件下果实品质提升的原因提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 试验材料
远程运维服务试验在西北农林科技大学北园艺场(34°20′N，108°24′E)进行，试材为7～8 a生的盆栽嘎啦Gala/M26苹果树。
1.2 试验方法
2016年3月选取生长状况基本一致且无病虫害的植株，栽于盆高50 cm×直径60 cm的塑料盆中，基质选用园地表层土壤、有机肥与种植基质混合而成，有机质的质量分数为5%，每盆基质约100 kg，栽后保持水分充足，并预防病虫害的发生。
处理1(干旱胁迫)：花后100 d，即7月15日开始用土壤烘干法控水，分别为田间最大持水量的75%～80%(CK1)、60%～65%(A)、50%～55%(B)，每株为1个重复，重复6次，每隔7～9 d采1次样，共5次。
采用土壤烘干法控制土壤水分：每天从盆中不同方位20 cm深处取土带回实验室，测定湿土及烘干后土质量，计算公式如下：田间持水量=(湿土质量-干土质量)/干土质量，根据所需控水程度补充定量水分。
处理2(外源ABA处理)：最佳采收期前20 d，即7月24日选取果型端正，生长状况一致无病
虫害的100个果实，用医用注射器将配置好的ABA溶液和蒸馏水从苹果果实萼端中心口注入果实气腔内，以没有机械损伤为成功，分为2个梯度，0(蒸馏水)(CK2)和1 mmol/L(ABA)，每个果实为1次重复，重复6次，3～4 d采1次样，共5次。
1.3 测定项目及方法
将果实分为两份，一份用来测定品质指标，单果质量、横纵径、度等外观品质，内在品质测定可滴定酸、可溶性固形物、硬度等；另一份用蒸馏水清洗后，将果实切块，用锡箔纸包裹置于液氮中带回实验室，存放于―80 ℃冰箱，用以测定葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖的质量分数和相关酶活性及内源ABA质量分数。
1.3.1 果实品质指标 用万分之一分析天平测单果质量，电子数显卡尺guanglu牌，分辨率为0.01 mm的游标卡尺，测纵横径，果形指数为果实纵径与横径比值。用CR-400度计测定果皮度，L*表示亮度，a*表示红绿度，b*表示黄蓝度。取匀浆用PAL-BX迷你数显折射计测可滴定酸和可溶性固形物，削皮后使用果实硬度计GY-J测果实硬度。
果实含水量：分别测定果实鲜质量(m1)；将果实置于65 ℃烘箱中烘8 h，取出冷却至室温，
称此时的质量，再烘1 h后，取出冷却至室温再次称量，重复以上步骤，直到恒量即为果实干质量(m2)，果实含水量=(m1-m2)/m1×100%。
1.3.2 可溶性糖质量分数 参照梁俊等[15]的提取方法及测定方法，并加以改进。具体为：准确称取1 g果实冻样，加入3 mL 超纯水，80 ℃水浴超声波提取30 min，重复3次，10 000 g离心10 min，合并上清液，用0.45 μm滤膜过滤待测。利用高效液相谱(HPLC)测定4种可溶性糖，果糖、葡萄糖、山梨醇和蔗糖。谱条件为-Sugar-PakTMI(Waters)谱柱，柱温80 ℃，检测器为示差折光检测器(Waters 410)，流动相为超V(纯水)∶V(甲醇)=200∶1。3d打印机制作
1.3.2 海藻糖质量分数 果实中海藻糖质量分数的测定参考Garg等[16]的方法，并适当改变。具体为：准确称取冻干样1 g，用3 mLφ= 85%乙醇75 ℃超声提取海藻糖30 min，13 000 g离心15 min取上清液，沉淀再加3 mL乙醇重新提取，最后上清混合，样品烘干，加1 mL蒸馏水复溶，用0.45 μm滤膜过滤待测。加入海藻糖酶将海藻糖分解为2分子葡萄糖，用葡萄糖试剂盒Sigma Glucose(HK)Assay Kit测定葡萄糖质量分数。
1.3.3 TPS和TPP活性 参考Ilhan 等[17]的方法并加以改进。酶液提取：液氮速冷果肉研磨成粉末于―80 ℃贮存。提取时，称取0.5 g果肉粉末加入2 mL 50 mmol/L 氨丁三醇-盐酸(p
H7.5)(Tris-HCl)缓冲液，其中含100 mmol/L NaCl,100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)和100 mmol/L 苯(PMSF)，置研钵于4 ℃下研磨。13 000 g 以下离心5 min，上清液于4 ℃下存贮，用于酶活测定。
TPS活性：反应体系包括50 mmol/L N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH 7.0)(tricine)，10 mmol/L 6磷酸葡萄糖，5 mmol/L 尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和12.5 mmol/L MgCl2，加入酶液后共0.4 mL，35 ℃下孵育30 min后，沸水浴5 min停止反应；第2个反应取上清液加140 mmol/L tricine(pH 7.6)，2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸，0.31 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态(NADH)和5U乳酸脱氢酶，加入5 U丙酮酸激酶后开始反应，用紫外分光光度计在340 nm处测定计算释放尿苷二磷酸(UDP)质量分数，用单位时间内释放的UDP质量分数表示TPS活性。
TPP活性：反应体系包括1 mmol/L 6-磷酸海藻糖，10 mmol/L MgCl2，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)加入酶液共2.5 mL体系，于37 ℃ 孵育30 min，沸水浴5 min停止反应；反应生成海藻糖，加入海藻糖酶后用葡萄糖试剂盒Sigma Glucose(HK)Assay Kit测定生成葡萄糖质量分数代表TPP活性。
尼龙包胶线
1.3.4 TRE活性 参考Lopez等[18]的方法并加以改进。酶液提取：称取0.3 g果肉粉末，加入2 mL提取液[100 mmol/L 2-(N-啉)乙磺酸-氢氧化钾(pH 6.3)(MES-KOH)含2 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和2 mmol/L 交联聚维酮(PMSF)]并加适量PVPP研磨成匀浆，13 000 g 4 ℃以下离心5 min，取上清液用于酶活测定。菌类生产
TRE活性：反应体系中酶液加入100 mmol/L 海藻糖，50 mmol/L MES-KOH(pH 6.3)缓冲液共0.6 mL，37 ℃孵育45 min后沸水浴5 min，反应生成的葡萄糖利用葡萄糖试剂盒(同上)测定生成葡萄糖表示海藻糖酶活性。
