基金项目：辽宁省教育厅项目，项目编号:JYTQN201732；锦州医科大学校级大学生创新项目，项目编号:201734㊂ 作者简介：李家辉(1998)，男，辽宁锦州人，在读本科生㊂
通讯作者：高宇(1984)，女，辽宁锦州人，副主任医师，博士学位，主要研究方向为纳米技术改善难溶物水溶性及抗肿瘤新剂型
研究㊂
李家辉1，崔海悦1，马晓茜1，高宇2
(1.锦州医科大学药学院;2.锦州医科大学附属第一医院肿瘤学教研室，辽宁锦州121000)
高炉 摘要：目的 构建介孔氧化铜纳米球(mesoporous copper oxide nanospheres ,MCON )负载紫杉醇(paclitaxel ,PTX )纳米药物传递系统(MCON-PTX )，考察其对SMMC-7721肝癌细胞抑制效果㊂方法 以介孔碳纳米球为模板，氯化铜为铜源，采用硬模板法制备介孔氧化铜纳米球，然后通过吸附法负载紫杉醇(PTX )得到MCON-PTX ㊂通过扫描电子显微镜㊁透射电子显微镜和差示扫描量热法对载药系统进行表 征，体外溶出实验考察PTX 释放行为，细胞实验考察MCON-PTX 对SMMC-7721肝癌细胞的作用效果㊂结果 MCON 的粒径为230nm ，载药量为(13.65±0.725)%㊂体外溶出结果表明,MCON 显著改善了PTX 的溶出速率㊂细胞实验表明MCON-PTX 显著改善了PTX 的肿瘤细胞抑制作用㊂结论 MCON 的介孔结构改善了难溶物PTX 的水溶性，是一个具有潜力的理想难溶物载体材料㊂草地悠波球
关键词：介孔；氧化铜；纳米球;SMMC-7721；紫杉醇
中图分类号:R944.9 文献标志码:A 文章编号:2096-305X (2020)06-0025-06
Preparation of Paclitaxel-Mesoporous Copper Oxide Nanospheres Drug Delivery
System and Its Effect on Hepatoma Cell SMMC-7721
Li Jiahui 1,Cui Haiyue 1,Ma Xiaoqian 1,Gao Yu 2
(1.College of Pharmacy of Jinzhou Medical University;
2.Department of Medical Oncology,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000China)Abstract :Objective To build paclitaxel-mesoporous copper oxide nanospheres (MCON-PTX)drug delivery system and inves⁃
tigate its inhibitory effect on SMMC-7721hepatoma cells.Methods Mesoporous carbon nanospheres was used as template and copper chloride as copper source.Mesoporous copper oxide nanospheres were prepared by hard template method,and MCON-PTX was then obtained by loading paclitaxel (PTX)by adsorption.The drug delivery system was characterized by scanning electron microscopy (SEM),transmission electron microscopy (TEM)and differential scanning calorimetry (DSC).The release behavior of PTX was in⁃vestigated by in vitro dissolution test,and the effect of MCON-PTX on SMMC-7721hepatoma cells was investigated by cell experi⁃ment.Results The particle size of MCON was 230nm and the drug loading capacity was (13.65±0.725)%.The results of in vitro dissolution showed that MCON significantly improved the dissolution rate of PTX.Cell experiments showed that MCON-PTX signifi⁃cantly improved the tumor cell inhibitory effect of PTX.Conclusion The mesoporous structure of MCON improves the water solubility
of PTX,an insoluble drug,which is an ideal insoluble drug carrier material with potential.
Key words :mesoporous;copper oxide;nanospheres;SMMC-7721;paclitaxel
近年来，恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年升高，恶性肿瘤已成为世界范围内人口死亡的主要原因之一[1]㊂根据2019年国家癌症中心发布的数据,
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，发病率居于第四位，死亡率均位于第二位[2]㊂大部分晚期恶性肿瘤患者已无手术机会，首选化疗，但很多抗癌
药物是不溶于水，其水溶性严重限制了化疗药物的吸收㊂紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一种已发现的最优秀的天然广谱抗癌药物之一，通过抑制微管蛋白的解聚，进而抑制细胞有丝分裂达到抗肿瘤作用，在临床上已经广泛用于乳腺癌㊁卵巢癌㊁肝癌㊁部分头颈癌和肺癌的[3-4]，并且效果很
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2锦州医科大学学报J Jinzhou Medical University
2020Dec.41(6)
好，但是其水溶性较差，水中溶解度仅6ng/ mL[5]，因此如何改善紫杉醇溶解性是目前晚期恶性肿瘤中亟需解决的问题，对于扩大其临床应用更具重要意义㊂
纳米材料是指材料的基本单元在纳米级的范围内，尺度约为100个原子紧密贴合，排列整齐㊂根据Ostwld-Freundilich方程和Noyes-Whitney方程[6]，纳米粒子尺寸小比表面积大，不但增加难溶药物溶解度或溶出速率，还能增加纳米粒与细胞膜或生物膜的接触㊂这些优点都有利于增加难溶药物吸收，这都为解决难溶物的水溶性和吸收问题提供了良好的机遇㊂纳米药物载体，是指粒径大小为10~5
00nm的纳米粒子应用纳米技术包裹或吸附药物，药物载体被细胞摄取后在胞内释放药物，从而实现安全有效的药物输送㊂目前用于改善紫杉醇溶解性的方法包括制备胶束[7-9]㊁脂质体[10]㊁纳米粒[11]等㊂已有的紫杉醇纳米药物，包括脂质体紫杉醇和白蛋白结合型紫杉醇㊂如Pacli⁃taxel liposome(脂质体紫杉醇)的缺点包括稳定性差㊁载药量低㊁不易保存等㊂白蛋白结合型紫杉醇(albumin-boundpaclitaxel,Abraxane)中，紫杉醇和白蛋白为直接结合，不存在过敏反应，但是无法调节药物释放，并且成本高，工艺复杂，价格昂贵[12]㊂
随着纳米技术的发展，介孔材料用于改善难溶物水溶性的应用引起了广泛的关注[13-14]，比如介孔硅材料[15-16]，介孔碳材料[17-19]等㊂根据国际联合会(IUPAC)的定义，孔径在2~50nm之间的纳米材料称之为介孔纳米材料(mesopore)，介孔纳米材料作为药物载体时，药物以无定形态存在于载体内部㊂药物存在状态与药物溶解度有关：当药物以无定型态存在时，溶解度最好㊂这类材料具有高的比表面积㊁大的孔容积㊁易改性等优势㊂本实验采用介孔氧化铜纳米球作为载体材料，在既往研究中，介孔氧化铜给药体系显示出了低毒㊁靶向肿瘤细胞㊁诱导细胞凋亡的作用[20]㊂本实验用介孔氧化铜纳米球给药体系的纳米效应，改善紫杉醇的水溶性，并考察了该给药体系对SMMC-7721肝癌细胞的作用㊂
1 仪器与材料
KQ-250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)㊁AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)㊁DF-101S恒温磁力搅拌器(郑州市亚荣仪器有限公司)㊁JEM-1010透射电镜(日本电子株式会社)㊁LC-2030高效液相谱仪(日本岛津公司)㊁TG22-WS台式高速离心机(上海赵迪生物科技有限公司)㊁HS-DSC-101差示扫描量热仪(上海和晟仪器科技有限公司)㊁ZEISS LSM 700激光共聚焦显微镜(上海莱瑟光谱仪器分析技术有限公司)HBS-1096酶标分析仪(深圳良谊仪器有限公司)㊂
紫杉醇PTX(纯度≥98%，西安天丰生物科技有限公司，批号:20151015)，间苯二酚(阿拉丁)，正硅酸乙酯(TEOS)，谷胱甘肽(GSH) (国药集团化学试剂有限公司),3-巯基丙基-三甲氧基硅烷(MPTMS)(阿拉丁)，甲醇(谱醇，天津光复精细化工有限公司)，噻唑兰(MTT), Hoechst33342，罗丹明鬼笔环肽，异硫氰酸荧光素(FITC),RPMI-1640培养基(北京鼎国昌盛生物科技有限公司)，其余试剂为市售分析纯㊂
2 方法与结果工业机器人装配
2.1 载体制备及载药研究
2.1.1 MCON的制备[19]
70mL乙醇㊁3mL氨水㊁10mL水置于磨口锥形瓶中混合均匀，然后3.46mL正硅酸乙酯滴加到上述溶液中，搅拌下反应15min，接下来加入0.4 g间苯二酚和0.56mL的甲醛，反应24h后，得到的白沉淀经干燥后，于700℃氮气氛围下煅烧7 h,5%的除去二氧化硅，得到介孔中空碳纳米球㊂取100mg介孔中空碳纳米球分散在10mL 1.5M的硝酸铜溶液中，搅拌24h后，离心得到的样品经干燥于500℃空气中煅烧3h，得到MCON㊂
2.1.2 载药研究
吸附法被用于载药研究㊂取200mg MCON分散于2mL的PTX二氯甲烷溶液(2mg/mL)中，经超声进一步分散后继续搅拌6h，离心得到的沉淀经真空干燥后，得到MCON-PTX㊂精密称量5.0 mg CS-SS-MSN-PTX/MSN-PTX置于10mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度㊂静置1h，离心，取上清液为供试品,HPLC法测定PTX浓度并计算载药量，按如下公式计算得到：载药量(DLC)% =包裹在APMSN载药体系中的紫杉醇重量/载药体系重量×100%㊂
2.2 表征
2.2.1 透射电子显微镜(transmission electron mi⁃croscopy,TEM)表征
采用透射电子显微镜(Tecnai G2F30,FEI,
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USA)观察MCON 的形态结构特征㊂
2.2.2 DSC 表征
差示扫描量热扫描仪检测PTX 在MCON 孔道
中的存在状态，实验条件为氮气氛围下从50~120℃以10℃/min 的加热速率进行扫描，绘制DSC 曲线㊂
2.3 体外溶出实验
根据2015版‘中华人民共和国药典“溶出度
测定第二法，考察MCON -PTX 和PTX 的溶出行为㊂取相当于3.0mg PTX 的原料药PTX 和MCON -PTX 分散于400mL pH =7.4PBS 中，在温度为
37.0℃和转速为100rpm 条件下，分别于5㊁10㊁20㊁30㊁45㊁60min 取样2mL，取样后补充等量空白释放介质㊂通过HPLC 法对PTX 进行定量分析，计算PTX 的累积溶出度㊂谱条件：使用的流动相
比例为甲醇-水(65∶35)，谱柱为Agi⁃lent TC-C 18(250mm×4.6mm,5μm)，柱温为30℃，检测波长为227nm，流速为1mL /min，进样量为20μL㊂
2.4 体外细胞实验2.4.1 细胞毒性实验
SMMC-7721细胞培养条件：培养基为含10%
血清的DMEM，温度为37℃,5%二氧化碳㊂试验中所用细胞均经过细胞计数㊂MCON-PTX 的细胞活力用MTT 法检测㊂5×104浓度的细胞被种到96孔板中，贴壁后，系列浓度的MCON,PTX㊁MCON-PTX 被加入孔中，孵育48h 每孔加入MTT 试剂20μL，孵育4h 后，去除介质，每孔加入
150μLDMSO㊂酶标仪在492nm 测定光密度值㊂2.4.2 细胞摄取实验
500mg MCON 置于100mL 锥形瓶中，在100
℃下干燥30min，降至室温后在氮气保护下加入
50mL 无水乙醇和2mL 的3-氨丙基三乙氧基硅烷,77℃下搅拌加热回流10h，经离心得到的样品用无水乙醇洗涤3次，真空干燥后置于1mg /mL 的FITC 无水乙醇溶液中，静置吸附3h，离心得到含有FITC 标记的MCON (FITC-MCON)㊂将细胞密度为5×104的对数期SMMC-7721细胞接种于共聚焦皿中，贴
壁后,50μg /mL MCON-PTX 分散液填加入共聚焦皿中,37℃下分别孵育1㊁2h，弃去培养基后用PBS 洗3次,4%多聚甲醛溶液固定10min,1mg /mL 的Hoechst 33342和1mg /mL 的罗丹明鬼笔环肽分别进行染，最后激光共聚焦显微镜(Leica DM-6000CS microscope,Germany)下观察SMMC-7721细胞对FITC-MCON 的摄取情况㊂
3 结果与讨论
电锅炉制造3.1 载体形态结构及载药研究
通过TEM 对制备的介孔碳纳米球和MCON 的
形貌进行表征㊂介孔碳纳米球呈单分散的球形颗粒，具有介孔中空结构，粒径分布约为230nm，见图1A㊂MCON 为核壳结构，是介孔碳纳米球结构的复制，其介孔壳结构能够提供足够的空间存贮药物并限制药物粒径大小，短的孔道距离具有相对低的扩散阻力，在改善PTX 的水溶性的同时有利于药物的快速释放㊂通过HPLC 测定载药量，得到PTX-MCON 载药量为(13.65±0.725)%，见图
1B㊂
A：介孔碳纳米球;B:MCON
图1 透射电镜图片
7
2李家辉，等：紫杉醇-介孔氧化铜纳米球给药体系的制备及对肝癌细胞SMMC-7721作用
3.2 DSC
采用差式扫描量热法对MCON㊁PTX㊁PTX -
旋转木马音乐盒
MCON㊁PM (PTX 和MCON 物理混合)和进行检测,PTX 在223℃显示吸热峰,PM 也在此温度出现吸热峰，表明将PTX 和PM 中药物是晶体状态,MCON 呈现一条平滑曲线，无相转变发生，表明载体是无定形的，见图2㊂PTX-MCON 未见PTX 的吸热峰，说明PTX 以无定型状态存在于MCON 的介孔结构中，无定型状态的药物具有更大的溶解度和溶出速率，这是PTX 溶出改善的原因
㊂
图2 DSC 曲线图
3.3 体外溶出实验
采用pH =7.4的PBS 作为溶出介质，考察
PTX-MCON 的溶出情况,PTX 原料药在5min 时，药物溶出(5.633±0.45)%，在1h 时药物累积溶出量仅为(20.198±1.48)%，相比之下,PTX -
MCON 中PTX 释放较快,5min 药物释放(10.536
±2.15)%,1h 累积溶出量为(86.347±3.06)%,
表明MCON 包载后的PTX 溶出速率得到显著的提高，见图
3㊂
图3 PTX-MCON 的累积溶出度
3.4 细胞实验
3.4.1 细胞毒性实验
通过MTT 法考察系列浓度的MCON 对SMMC-
7721细胞的作用效果，评估MCON 的生物相容性㊂SMMC-7721细胞在浓度10~500μg /mL 的MCON 孵育48h 后细胞活力均高于80%，这表明MCON 对SMMC-7721细胞具有良好的生物相容性，见图4A㊂通过系列浓度的PTX 和PTX-MCON 对SMMC -7721细胞的抑制率评价载药样品的细胞毒性,PTX 和PTX-MCON 孵育的SMMC-7721细胞在10~500ng /mL 浓度范围内细胞毒性呈现浓度依赖
性，并且PTX-MCON 具有更强的细胞毒性，见图
4B㊂
图4 MCON (A )㊁PTX 和PTX-MCON (B )对SMMC-7721的细胞毒性作用
3.4.2 细胞摄取实验
通过激光共聚焦显微镜观察SMMC-7721细胞
在0.5㊁1h 对FITC-MCON 的摄取情况㊂根据荧光强度变化说明FITC-MCON 能够被细胞摄取跨膜进
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入细胞质，并呈时间依赖性实验，见图
5㊂
图5 FITC-MCON 被细胞摄取的激光共聚焦图像
4 结 论
本研究制备了MCON，并以其为载体改善难溶物PTX 的水溶性，载药样品中PTX 以无动态存在，体外溶出结果说明PTX-MCON 明显改善了PTX 的溶出速率㊂细胞实验结果进一步表明PTX-MCON 对SMMC -7721细胞的显著抑制作用㊂综上,MCON 是一种具有改善难溶物水溶性的潜力载体，为改善难溶性抗肿瘤药物疗效提供参考㊂参考文献:
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