限制性内切酶酶切位点保护碱基

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寡核苷酸近末端位点的酶切

(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列

首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变

酶	寡核苷酸序列	链长	切割率%
			2 hr	20 hr
Acc I	GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG	8 10 12	0 0 0	0 0 0
Afl III	CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG	8 10 12	0 >90 >90	0 >90 >90
Asc I	GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA	8 10 12	>90 >90 >90	>90 >90 >90
Ava I	CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA	8 10 12	50 >90 >90	>90 >90 >90
BamH I	雨水管理系统CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG	8 10 12	10 >90 怎么自制纳米胶 >90	25 >90 >90
Bgl II	CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC	8 10 12	0 75 25	0 >90 >90
BssH II	GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA	8 10 12	0 0 50	0 0 >90
BstE II	GGGT(A/T)ACCC	9	0	10
BstX I	AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT	22 24 27	0 25 25	0 50 >90
Cla I	CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG	8 8 10 12 真空管道磁悬浮列车	0 0 >90 50	0 0 >90 50
EcoR I	GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG	8 10 12	>90 >90 >90	>90 >90 >90
Hae III	GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA	8 10 12	>90 >90 >90	>90 >90 >90
Hind III	CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG	8 10 12	0 0 10	0 0 75
Kpn I	GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG	8 10 12	0 >90 >90	0 >90 >90
Mlu I	GACGCGTC CGACGCGTCG	8 10	0 25	0 50
Nco I	CCCATGGG CATGCCATGGCATG	8 14	0 50	0 75
Nde I	CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC	8 10 12 18 20 22	0 0 0 0 75 75	0 0 0 0 >90 >90
Nhe I	GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG	8 10 12	0 10 10	0 25 50

Not I	TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA	12 16 20 24 28	0 10 10 25 25	0 10 10 90 >90
Nsi I	TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT	12 22	10 >90	>90 >90
Pac I	TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG	8 10 12	0 0 0	0 25 >90
Pme I	GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG	8 10 12 24	0 0 0 75	0 25 50 >90
Pst I	GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT	8 14 22 24 26	0 10 >90 >90 0	0 10 >90 >90 0
Pvu I	CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA	8 10 12	0 10 0	0 25 10
Sac I	CGAGCTCG	8	10	10
Sac II	GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA	8 12	0 50	0 >90
Sal I	GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA	28 30 32	0 10 10	0 50 75
Sca I	GAGTACTC AAAAGTACTTTT	8 12	10 75	25 75
Sma I	CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA	6x射线探测器 8 10 12	0 0 10 >90	10 10 50 >90
Spe I	GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG	8 10 12 14	10 10 0 0	>90 >90 50 50
Sph I	GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT	8 12 14	0 0 10	0 25 50
Stu I	AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT	8 10 12	>90 >90 >90	>90 >90 >90
Xba I	CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA 生殖器疱疹新药CTAGTCTAGACTAG水表箱	8 10 12 14	0 >90 75 75	0 >90 >90 >90
Xho I	CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG	8 10 12	0 10 10	0 25 75
Xma I	CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA	8 10 12 14	0 25 50 >90	0 75 >90 >90

DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列

本文发布于:2023-05-18 08:48:19，感谢您对本站的认可！

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