各种酶切位点的保护碱基

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各种酶切位点的保护碱基

酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。

寡核苷酸近末端位点的酶切

(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应

缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

取石网篮

酶	寡核苷酸序列	链长	切割率%
			2 hr	20 hr
Acc I	GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG	8 10 12立体交叉桥	0 0 0	0 0 0
Afl III	CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG	8 10 12	0 >90 >90	0 >90 >90
Asc I	GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA	8 10 12	>90 >90 >90	>90 >90 >90
Ava I	CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA	8 10 12	50 >90 >90	>90 >90 >90
BamH I	CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG	8 10 12	10 >90 >90	25 >90 >90
Bgl II	CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC	8 10 12	0 75 25	0 >90 >90
BssH II	GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA	8 10 12	0 0 50	0 0 >90
BstE II	GGGT(A/T)ACCC	9	0智能公话	10
BstX I	AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT	22 24 27	0 25 25	0 50 >90
Cla I	CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG	8 8 10 12	0 0 >90 50	0 0 >90 50
EcoR I	GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG	8 10 12	>90 >90 >90	>90 >90 >90
Hae III	GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA	8 10 12	>90 >90 >90	>90 >90 >90
Hind III	CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG	8 10 12	0 0 10	0 0 75
Kpn I	GGGTACCC电热碗 GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG	8 10 12	0 >90 >90	0 >90 >90
Mlu I	GACGCGTC CGACGCGTCG	8 10	0 25	0 50
Nco I	CCCATGGG CATGCCATGGCATG	8 14	0 50	0 75
Nde I	CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC	8 10 12 18 20 22	0 0 0 0 75 75	0 0 0 0 >90 >90
Nhe I	GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG	8 10 12	0 10 10	0 25 50

Not I	TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA	12 16 20 24 28	0 10 10 25 25	0 10 10 90 >90
Nsi I	TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT	12 22	10 >90	>90 >90
Pac I	TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG	8 10 12	0 0 0	0 25 >90
Pme I	GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG	8 10 12 24	0 0 0 75	0 25 50 >90
Pst I	GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT	8 14 22 24 26	0 10 >90 >90 0	0 10 >90 >90 0
Pvu I	CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCG清理块CGA	8 10 12	0 10 0	0 25 10
Sac I	CGAGCTCG	8	10	10
Sac II	GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA	8 12	0 50	0 >90
Sal I	GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA	28 30 32	0 10 10	0 50 75
Sca I	GAGTACTC AAAAGTACTTTT	8 12	10 75	25 75
Sma I	CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA	6 8 10 12	0 0 10 >90	10 10 50 >90
Spe I	GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG	8 10 12 14	10 10 0 0	>90 >90 50 50
Sph I	GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT	8 12 14	0 0 10	0 25 50
Stu I	AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT	8 10 12	>90 >90 >90	>90 >90 >90
Xba I	CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG	8 10 12 14	0 >90 75 75	0 >90 >90 >90
智能机器人问答 Xho I	CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG	8 10 12	0 10 10	0 25 75
Xma I	CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA	8 10 12 14	0 25 50 >90	0 75 >90 >90

2.双酶切的问题

参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。

有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。

两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。

 

3.酶切底物DNA，切不开

1）底物DNA上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。

2）PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。

PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。

3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的DNA，同样量，用不同的限制酶切情况可能不同，由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。

4）公司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用buffer稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。

不同公司的酶和buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。

5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中，重新制备DNA，也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增，再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响，通常选用GM33做宿主菌转化。

6）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉

淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。

 

4.DNA经酶切后，电泳无带或出现smear现象

DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。可以用DNA上的其他酶，也可以用此酶切其他DNA来检查问题所在。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。

 

5.甲基化酶

M.Alu I,  M.Bam H I,  M.RcoR I不属于CG甲基化，dam甲基化，也不属于dcm甲基化。

甲基化酶作用后，DNA不能被相应的酶切断。

本文发布于:2023-05-18 08:46:35，感谢您对本站的认可！

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