分表征的鉴定
合毒索蛋白B7-2.PE40KDEL2
新型重组融合毒素蛋白B7.2.PE4OKDEL部分表征的鉴定①
关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
(北京军事医学科学院附属医院免疫学研究室及国家生物医学分析中心免疫学研究室，北京100071)
157?
中国图书分类号R392.11文献标识码A文章编号1000-484X(2008)02-0157-04
[摘要]目的：对构建的新型重组B7-2.PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分表征进行分析鉴定.方法：采用SDS—PAGE 相对分子量，胰蛋白酶消化的MALDI.TOF.MS质谱，蛋白印迹，全波长扫描和MTr法分别测定该融合蛋白相对分子量，肽谱,
抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性.结果:B7-2.PE40KDEL经12%SDS—PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算，其相对
分子量为72628，与理论预测值69561相比误差在5%之内；全波长扫描分析显示该目的蛋白分别在225am和276nm处各
有一吸收峰;MALTI.TOF.MS质谱测定共获得15个与理论预测值相符的肽段，经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服
务网站的Peptident数据库搜索证明，在分子量为60000—80000的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白，证明本融合
蛋白为全新蛋白，与我们预测的目的蛋白相符;Westernblot实验显示B7—2一PE40KDEL能与人B7-2及PEA抗体特异性结合;
MTr杀伤活性测定表明，该融合蛋白对表达CD28的人T淋巴瘤细胞系Jurkat产生特异性杀伤，而对不表达的CD28一淋巴细 胞系Raji无任何杀伤.结论：重组B7.2.PE40KDEL外毒素融合蛋白为一全新的具有靶向B7:CD28细胞杀伤活性的蛋白质.
[关键词]重组外毒素融合蛋白;B7.2.PE40KDEL；肽谱；抗原特异性；生物学活性AnalysisofbiochemicalandphysicalpropertiesforanewrecombinantB7? PseudomonasexotoxinfusionproteinB7-2.PE40KDEL
GUANHai-Rong,SUNY u-凡g,YUANZhi—Hong,ZHANGHui-Li,LIANGFei,Nan,GUOSi-Qi,XICai—
Xia,XIy0凡g-Zhi.DepartmentofImmunology,AffiliatedHospitalforAcademyofMilitaryMedialSciences,Labo- ratoryofImmunoassayNationalCenterofBiomedicalAnalysis,Beijing100071,China [Abstract]Objective:Identificationofsomebiochemicalandphysicalpropertiesforanewrecombinant B7-2一PE40KDELexo—
toxinfusionprotein.Methods:12%SDS—PAGEseparatingandgelimaginganalyzing,peptidemassfi ngerprinting,Westernblotand MTrassasyingwereusedrespectivelyforidentificationoftheprotein.Results:Molecularweightofthere combinantB7-2一PE40KDEL
was72628.5%ofthedifferencetoitstheoreticalvalue69561.TheresultofWesternblotindicatedthatthe purifiedrecombinantB7—
2-PE40KDELcouldspecificallybindwithmAbanti—humanB7-2andtheantibodyagainstPEA,while thenegativecontroldidnot.The
recombinantB7-2一PE40KDELdigestedwithtrypsinandthendetectedbyMOLTI—TOF—MS.Itwasshownthatthedetecte d15peptides
liedintheextracellularpartofB7—2andthetruncatedPseudomonasextoxinPE40KDEL.Searchingint hepeptidentdatabankofEx.
pasywebsite,wedidnotfindanyknownproteinswhichwasaccordantwiththeaboveterms.Thecytotoxi cactivityoftherecombinant
toxinwithMTrmethodshowedthattheB7-2一PE40KDELselectivelykilledJurkatcelllinewhichexpressesedCD28receptorwelland hadnokillingeffectontheRajicelllineunexpressingCD28receptor.Conclusion:RecombinantB7-2.P E40KDELexotoxinfusionpro. teinweconstructprovestobeanewonewithtargetedkillingbioactivitytoB7:CD28system. [Keywords]Recombinationexotoxinfusionprotein;B7-2一PE40KDEL;Peptidemassfingerprinting;Antigenspecificity;Biogical
大功率led驱动电源
activity
20世纪80年代末国外科学家开始探索细胞因
子_夕毒素融合蛋白的结构与功能，国内这一领域的
①本文为国家自然科学基金资助课题(No.302001l1)
作者简介：关海容(1979年一)，男，硕士，实习研究员，主要从事分子
血液/免疫学相关的基础与应用基础研究;
通讯作者及指导教师：孙玉英(1973年一)，女，副研究员，主要从事分
子血液/免疫学相关的基础与应用基础研究;
奚永志(1964年一)，男，研究员，博士生导师,
主要从事分子血液/免疫学相关的基础与应用
基础研究.
研究亦随之起步….为了改善或克服目前国际上
阻断B7:CD28/CTLA一4共刺激信号系统诱导免疫
耐受防治GVHD或HVGD策略中所存在的缺陷或
弊端，研创出能特异性防治或减弱GVHD和HVGD
的新一代措施，我们研究室以B7:CD28/CTLA4系
统为靶标，采用基因融合SOE策略，在国际上首次
成功构建了全新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7.
1-PE40KDEL及B7-2一PE40KDEL的表达载体4J.
通过对其表达的优化以及下游的分离纯化，我们可
以获得大量高纯度的该重组蛋白，因此有必要对该
融合蛋白的物化表征进行详细的分析，以作为确证
B7-2一PE40KDEL为全新蛋白极其重要的依据.因为从蛋白质工程的角度来讲，对于任何一个功能性
蛋白质而言，无论是天然存在还是按照人们意愿设
计改构，定点诱变乃至于融合重组研制的，无论是生
物合成的还是基因工程表达的，一旦获得一定数量
的纯品，除了要系统深入地研究其结构序列，生物学
功能外，还要对其表征进行充分的研究，这在基因工
烧录ic程产品的鉴定中，美国FDA的药批规章中已有明确的硬性规定.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1重组融合蛋白与靶细胞本研究室构建纯
化分离的高纯度B7-2一PE40KDEL融合蛋白.Jurkat (CD28受体阳性)和Raji细胞(CD28受体阴性)分
别为人T和B淋巴细胞白血病细胞系，本室保存. 1.1.2主要试剂彩低分子量蛋白marker(Gib—
CO公司);CAN(谱级，华美公司);TFA(谱级, ACROS公司);PVDF膜(POLE公司)；胰蛋白酶(测 序级)及兔抗PE多抗(Sigma公司)；鼠抗B7-2单抗(ANCELL公司)；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠及碱性
磷酸酶标记的羊抗兔(华美公司);PE标记的CD28
单抗(Beckman公司)；胎牛血清(56℃灭活，华美公司).
1.1.3主要实验仪器MiniProteinH型蛋白电泳
仪，蛋白电转仪及酶联仪550型(Bio—Rad公司); ReflexⅢ型质谱仪(Bruker公司);Gel—Pro3.1凝胶
成像系统(MediaCybemetic公司)；分光光度计
DU640及离心机(Beckman公司);CO培养箱(Rev—CO公司).
1.2方法
1.2.1Westernblot印迹实验将纯化后的目的蛋
白液分别制样进行10%SDS—PAGE蛋白电泳，除去PAGE胶的浓缩胶部分.将分离胶胶片与硝酸纤维
耐热粘合剂素膜用转移缓冲液平衡30分钟，并将专用滤纸用转移缓冲液浸湿.按照半干转移仪说明操作，将蛋白
转移到膜上；用含10%的小牛血清/PBS/叠氮钠封
闭液封闭2小时，然后加入两种一抗孵育1～2小时；再用PBS洗涤3次，用0.1mmol/LTris—HC1,
0.05mol/LNaC1洗涤，尽量将磷酸盐洗净；再用
10%小牛血清,Tris—HC1，作为二抗体稀释液稀释二抗，二抗与膜孵育1小时；随后用0.1mol/LTris—
HC1,0.15mol/LNaC1至少洗涤3次，最后用NBT/ BCIP试剂盒进行显，至适当的显程度用蒸馏水
中国免疫学杂志20o8年第24卷
洗去染液终止反应.
1.2.2胰蛋白酶酶解凝胶肽谱的制备将纯化的
B7-2一PE40KDEL进行10%SDS—PAGE电泳后，经考马斯亮蓝染，脱，将凝胶上相应的蛋白带切下,
用干净的解剖刀将胶带切成1～2mm.大小的胶
片，用水清洗几次后用含50%ACN的25mmol/L碳
酸氢氨溶液50～100l浸泡胶片，震荡20分钟，弃
永磁铁氧体去溶液，重复1～5次，使蓝完全褪去.将上述处
粽子机
理的凝胶真空冷冻离心干燥20分钟，以使胶片完全
脱水体积缩小，而后加入25mmol/L碳酸氢铵稀释
的胰蛋白酶5～10l(0.01g/1)，在4~C冰箱放
置20～30分钟，待酶液完全被吸收后，补充5～10
l25mmol/L碳酸氢铵液,37℃保温15小时.加
5%TFA50～100l，于40℃保温1小时，吸出上清
液，再加含2.5%TFA的50%ACN50～100l，于
30~C保温1小时，吸出上清液，合并上清液，冰冻干
燥12小时.最后加5～10l0.5%的TFA溶液，混
均后做MALDI—TOF—MS质谱.
1.2.3相对分子量的测定将蛋白相对分子量标
准及B7-2一PE40KDEL纯化样品进行12%SDS—PAGE 电泳后，用考马斯亮蓝R-250染，脱后利用凝胶
成像系统进行相对分子量的计算.
1.2.4全波长扫描采用Beckman公司的DU640
型分光光度计对纯化后的目的蛋白进行了200～
600nm波长扫描.
1.2.5MTr法检测特异性杀细胞活性分别收集
处于对数生长期的Jurkat细胞和Raji细胞，将细胞
计数继电器
用RPMI1640洗3遍后计数，以5×10个/孔的细胞
浓度加入96孔培养板中，将纯化的蛋白以0.22m
孔径的滤膜过滤除菌后，按照2倍梯度稀释后分别
加入各细胞培养孔中,37oC,5%CO全湿度培养72
小时，用MTr法检测B7-2一PE40KDEL融合蛋白的
细胞毒杀伤作用.
2结果
2.1重组B7-2一PE40KDEL融合蛋白的免疫印迹鉴
定其结果证实所分离纯化的产物均能与B7-2单
克隆抗体和PEA多抗发生特异反应，在70000处出
现强烈的反应带，而阴性对照在相应位置则未见任
何显条带，见图1,2.
2.2重组B7-2一PE40KDEL融合蛋白的肽谱分析
本实验采用了胰蛋白酶法进行酶解B7—2一PE40KDEL 融合蛋白，经MALTI—TOF—MS质谱测定，共获得15
个肽段，见图3，这些肽段均可以在B7-2一PE40KDEL
中到相对应的部分，见表1.将上述结果经瑞士
合毒素蛋白B7-2一PE40KDEL
生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索显示，在分子量为60000～
80000左右的范围内未检索到与上述条件相符的
已知蛋白，由此证明本融合蛋白为全新蛋白，与我们
23
图1免疫印迹(抗B7-2单抗)
Fig.1WesternblotwithmAb(anti-B7-2l
Note:Lt~ffle1.Negativecontrol;Lane2.Purifiedaimedprotein;Lane 3.Colormarker.
23
图2免疫印迹(抗PEA多抗)
Fig.2Westernblotwithantibody(anti-PEA)
Note:Lane1.Unpurifiedaimedprotein;Lane2Purifiedaimedprotein; L%ne3.Concentratedaimedprotein.
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图3胰蛋白酶切后MOLT][-TOF-MASS检测结果
Fig.3ResultofMOLTI-TOF-MASSafter~tttlngbytrypsin
2l59
预测的目的蛋白完全相符.
2.3重组B7.2.PE40KDEL融合蛋白的分子量分析
根据12%SDS.PAGE蛋白电泳的结果(图4)和凝
胶成像系统分析结果(图5)所示，进行相对迁移率
计算可知，重组B7-2.PE40KDEL融合蛋白的相对分
子量为72628，与理论预测值69561相比，误差在
5%之内.
2.4重组B7-2.PE40KDEL融合蛋白的全波长扫描
分析全波长扫描分析B7-2一PE40KDEL的结果显
示，该目的蛋白分别在225nm和276nm处各有一
吸收峰，见图6.
表1胰蛋白酶切所获肽段质核比及对应氨基酸序列
-chargeratioinmassspectrometryof peptidesobtainedaftercuttingbytrypsinandcor- respondencesequenceofaminoacid
Them/zofThecorrespondence
sequenceofaminoacid
SSLPGFYR
