作者：林升钦
上海交通大学生命学院研究生
学号：0080809027
摘要：藻类微生物的大规模爆发已成为一个世界性的环境问题。关于如何治理这个问题，各国的科研工作者采取了许多不同的策略，也做了大量的科研工作，取得了一定的成就。本文旨在介绍关于溶藻微生物以及溶藻物质的研究进展，并讨论微生物治藻的可行性。为藻类大规模爆发问题的治理提供一定的建议，对于治藻方法的应用提供一种策略。 关键词：溶藻菌溶藻物质富营养化
富营养化是一个全球性的、有着广泛影响的环境问题。由富营养化引起的藻类短时间内爆发，产生了一系列问题。在淡水中藻类短时间内大规模爆发的现象，称为“水华”，而在海水中则称为“赤潮”。藻类的大规模爆发，对于水产业、供水系统和生态环境都造成严重的影响，更需注意的是，水体中的一些有毒藻类，如淡水中的微囊藻科（micrcystis）、海水中的甲藻门（Dinoflagellata）等类别中一些藻种，能够产生毒素，对水生动物和人有着毒害作用，这些情况已经有着很多的报道。黄花菜加工
对于如何阻止藻类的大规模爆发，人们试行了很多的方法。有物理法、化学法、生物法等。物理法主要是控制水体中的一些营养盐的浓度，降低水体的富营养化程度，甚至使之变为中度营养化，如从源头上控制营养盐进入水体。物理法是一个长期的工作，需要多方面的措施，对于短期内控制藻类爆发并没有太大的帮助。化学法主要是往水体中投入硫酸盐、粘土等物质，短期内使藻类死亡或沉入水底。这种方法有可能会造成后续的不可估计的生态破坏作用。现在人们更多的把目光集中到生物方法上。如种植水生植物、投入原生动物和鱼类、投放溶藻微生物等。目前关于投放溶藻细菌方面已有着一些进展。
溶藻细菌（algicidal bacteria）是一类以直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称。
有关溶藻细菌的报道最早的是粘细菌属（myxobacter）。1924 年,Geitler报道了一株寄生在刚毛藻上、可使之死亡的粘细菌〔1〕。Shilo 用几种从水塘中分离出来的粘细菌做溶藻试验, 测试的10 种蓝藻中有8 种被溶解。Daft 从废水中分离出9 种粘细菌, 可溶解鱼腥藻、束丝藻、微囊藻以及多种颤藻〔2〕。李勤生等也报道了粘细菌同蓝藻细胞相互接触, 导致藻细胞溶解的现象〔3〕。沼气储气罐
已经发现的溶藻细菌很多属于γ-变形菌门（γ-Proteobacteria）。K. H. Baker 等发现某种假单胞菌能分泌一种能够杀灭硅藻的高分子质量的热稳定化合物〔4〕。A. Dakhama 报道铜绿假单胞菌产生一些低分子质量的扩散类吩嗪素物质, 可以强烈溶解一些蓝藻和
绿藻〔5〕。S.W.Jung等人从韩国的一个水库中发现一株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）能够杀死冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii）。（6）赵传鹏等从太湖梅梁湾水域放置的除藻中试反应器的人工介质上分离出一株假单胞菌，该菌在太湖中对微囊藻24 h 藻细胞溶解率为85.9%, 对微囊藻毒素LR(ML- LR) 也有较强的降解作用〔7〕。L. Connio 等对澳大利亚南部的Huon 河口进行细菌种调查时分离到一株交替假单胞菌Y, 对有害的水华藻类(Gymnodinium,Chattonella, Heteyosigm) 有溶解作用, 但是对某种骨条藻和蓝藻(Oscillatoria sp.) 不敏感〔8〕。
近年来, 国内外文献中陆续有一些其他溶藻细菌的相关报道, 主要有: 从日本海域分离
出的具有溶藻效应的黄杆菌属〔9〕, 从武汉市的四个池塘分离出的分别属于葡萄球菌属、芽孢杆菌属、节杆菌属以及欧文菌的溶藻细菌〔10，11〕, 从海绵固定化微生物系统中分离得到的具有良好溶藻效应的红球菌〔12〕。另外，报道的具有溶藻作用的细菌还有蛭弧菌属(Bdellovibrio bacterious) 、屈挠细菌属( Flexibacter) 、腐生螺旋体属( Saprospira sp.) 、杆菌(Bacillus) 、弧菌(Vibrio) 、产气单胞菌等〔9〕。这些细菌多为革兰氏阴性菌, 它们的作用对象比较广泛, 既有蓝藻, 也有硅藻和甲藻。
由于溶藻细菌在自然水体中的比率较低, 采用传统方法分离比较困难, 加之环境因子
的多变性、部分细菌溶藻能力的不稳定性〔4〕, 尤其是原先注重物理、化学方法杀藻除藻, 因此, 溶藻细菌的研究一直没有引起足够的重视。近些年来, 湖泊水库富营养化引起的藻类过度繁殖的问题越来
越突出, 在利用物理、化学和其他生物方法治理水华不甚理想的情况下, 溶藻细菌作为水华和赤潮防治的生物, 引起人们极大的关注〔13〕, 但国内对溶藻细菌的研究还不够重视, 目前仅处于起步阶段, 对于溶藻物质的研究尚属空白, 在分子生物学水平上对溶藻细菌研究更未涉及。国外对溶藻细菌的报道不仅有溶藻细菌的分离、溶藻现象的描述以及溶藻细菌的生理生化鉴定, 溶藻细菌分子鉴定，同时对于溶藻物质的鉴定、基因定位也有着一定的研究。Sun-Og Lee等人不仅鉴定出一株假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）的溶藻物质是丝氨酸蛋白酶，同时克隆得到这种丝氨酸蛋白酶的基因。（14）
细菌溶藻的作用方式
溶藻细菌的作用方式一般分为两种: 一是直接溶藻, 即直接进攻宿主, 它需要细菌与溶藻细胞直接接触, 甚至侵入藻细胞内; 二是间接溶藻, 即间接进攻宿主, 主要包括细菌同藻
竞争有限营养或细菌分泌胞外物质溶藻〔15〕。其中分泌胞外物质溶藻文献报道较多, 是溶藻细菌的主要作用方式。研究溶藻细菌的作用方式不仅可以了解溶藻细菌的作用机制, 而且可以为分离和研制高效的杀藻剂提供理论指导。
直接溶藻
细菌通过接触藻细菌来杀死藻的报道并不多，但也有着一些。Y.-H. Kang等人发现一株恶臭假单胞菌通过直接溶藻方式杀死冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii）。（16）间接溶藻
细菌可以通过释放特异性或非特异性的胞外物质, 如蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素和羟胺等杀死藻细胞。这类细菌常见的有弧菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌，假交替单胞菌( Pseudoalteromonas) 等。目前报道的细菌杀藻物质主要有以下几类。
1.蛋白质 Lee 分离的一株海洋细菌假交替单胞菌A28 ( Pseudoalteromonas sp. A28)能杀死骨条藻( Skeletonema costatum NIES2324) 。纸片法检测(paper disk assay) 表明:A28 培养液上清具有强烈的杀藻活性。将A28 的上清液用10 ,000Mw 的滤膜超滤所获得的浓缩上清液显示出杀藻活性, 这表明A28 能产生细胞外大分子物质杀藻。100 ℃加热15 min 或68 ℃加热1h , A28 的上清液会失去杀藻活性, 检测表明浓缩的上清液有蛋白酶和DNase 活性。采用诱变剂N2甲基2Np2亚硝基胍(NTG) 诱变后选育出两株无杀藻活性的A28 的突变株NH1 和NH2。NH1 和NH2 的上清液中的蛋白水解酶活性要比A28 低15 %。应用离子交换层析后通过制备凝胶电泳来纯化A28 的蛋白水解酶, 纯化的蛋白水解酶具有强烈的杀藻活性。该蛋白水解酶为单体蛋白, 分子量约为50kD , N 末端的氨基酸序列经测定为Ala-Thr-Pro-Asn-Asp-Pro 。用succinyl2Ala2Ala2Pro2Phe2p2nitroanilide 作为底物进行实验, 结果表明该蛋白酶的最适pH 和最适温度分别为818 和30 ℃。其活性能被苯(PMSF , 一种Ser 抑制剂) 、二异丙基氟磷酸(DFP) 、抗蛋白酶、胰凝蛋白酶抑制剂和亮抑酶肽强烈抑制。而EDTA、EGTA、邻
二氮杂菲、四乙烯五胺, 对它则没有明显
抑制作用。这些结果表明A28 能产生一种胞外丝氨酸蛋白酶杀藻[17]。
2.多肽 Imamura 从Biwa 湖采集的含微囊藻的水样中分离一株细菌, 通过16S rDNA
序列分析及分类研究, 将其归类于鞘氨醇单胞菌属( Sphingomonas sp. ) , 该菌株能够分
泌一种对微囊藻有强烈杀灭活性的五肽argimicin A , 分子式为C32 H62N12O8。它在12 μg/mL 和100μg/mL 时分别对绿微囊藻( Microcystis viridis NIES2102) 和铜绿微囊藻( M.aeruginosa NIES2298) 有着很强的杀藻活力。但对大肠杆菌( Escherichia coli
IAM12119) 、枯草杆菌( Bacillus subtilis IFO3027) 、小球藻( Chlorella vulgaris IAMC227) 无效果。(18)
3．氨基酸 Yoshikawa 从日本西南的一些岛(Yap , Palau , Okinawa) 采集水样分离细菌, 进而筛选具有抗蓝藻活性的细菌。在供试的2594 株分离细菌中, 有37 株能产生抗颤藻( Oscillatoria amphibia NIES2361) 的物质。其中的一株C2979 , 经鉴定为Vibrio sp. ，将其培养在2.4 L 的海洋肉汤2216 培养基中, 用来鉴定该菌产生的生物活性物质。通过仪器分析以及应用高级Marfey 法, 确定了这种被纯化的强亲水性化合物为β-氰基-L-丙氨酸(L-CNAla) 。这是首次报道细菌在没有供应氰离子的培养基中产生
了β-氰基-L-丙氨酸。该化合物不抑制细菌、酵母菌和真核微藻的生长, 但发现一些蓝藻对0.4-25μg/mL 的该化合物敏感。用薄层层析法检测了37 种能产生抗蓝藻物质的分离细菌在海洋肉汤中是否产生β-氰基-L-丙氨酸, 结果表明其中的36 株细菌的培养物中含有β-氰基-L-丙氨酸, 这表明海洋细菌的β-氰基-L-丙氨酸产物是广泛分布的[9 ] , 该化合物可能是影响海洋藻类种动力学的一个重要因素。
几年之后，Yoko Yamanoto等人发现一株链霉菌分泌的L-lysine能够裂解蓝藻。【19】4．抗生素 Dakhama 发现一株铜绿假单胞菌能释放低分子量, 热抗性物质, 对供试的绿藻和蓝藻的生长有强烈的抑制作用。这种杀藻物质对不同的酶都具有抗性, 在避光条件下, 于4 ℃的琼脂中保存3 个月后仍有活性。铜绿假单胞菌可产生一系列抗生素物质, 例如不同的吩嗪素, PYO (脓) 化合物, 糖脂类等。经检测表明铜绿假单胞菌通过释放琼脂扩散性吩嗪素对宿主藻类的生长起抑制作用。绿脓素和一种未鉴定的浅蓝素对宿主藻类的生长没有效果, 而12羟基吩嗪和氧绿菌素却有强烈的抗藻活性[5 ]。
生殖器疱疹新药5．含氮化合物 Paul 的研究发现分离的一株活性硝化细菌—节杆菌
( Arthrobactersp. ) 能抑制小球藻( Chlorella vulgaris) 。该菌是通过氧化铵或其它还原性的氮化合物时释放的羟胺起作用。将该菌在平板上培养时, 可积累5μg/mL 的N2羟胺。小球藻对低于0124μgPmL 的N2羟胺敏感。作者还检测到10μg/mL 的肟对小球藻也有抑制效果[18 ]。
6．其它细菌杀藻物质 随着藻类学、水生生态系统和环境科学研究的进展, 溶藻细菌的杀藻物质被不断
报道。Lovejoy 通过细菌的培养物滤液实验发现一株假交替单胞菌分泌细胞外物质溶藻[8 ]。Baker 发现某种假单胞菌T827P2B 分泌一种高分子量的热不稳定的化合物, 能够杀死硅藻( Thalassiosira pseudonana ) [4 ]。Shinsaku 证明了施氏假单胞菌释放一些高活性的杀藻物质, 能够选择性地杀死绿胞藻类的Chattonella antigua , 最低的致
死浓度为015 % , 但与之共同培养的黄尾鱼却不受任何影响[12 ]。Hayashida 分离的菌株EHK21 能产生一种扩散性溶藻物质来杀死Heterocapsa circularisquama[13 ]。Ishio 报道弧菌( Vibrio algoinfestus ) 能产生甲藻抑制剂DGI ( dinoflagellated growth inhibitor) 杀死Chattonella antiqua[1 ] 。这些细菌杀藻物质大都未被鉴定, 溶藻机制仍不十分清楚.
利用溶藻细菌治理水华, 可使水环境保持生态平衡, 从而达到防止赤潮的目的。但在以菌治藻的工程实施之前还有大量的研究工作要开展, 例如: 溶藻细菌的驯化、安全性评价和在天然水体中的适应性研究, 溶藻细菌载体、富集方式的研究, 杀藻作用与细菌种属特异性的关系, 细菌的投放量、投放时间以及水体的营养程度的影响研究等.
目前在分子水平上对细菌杀藻物质的作用机制研究甚少。要加强对分泌杀藻物质的细菌的分子生物学研究, 克隆编码杀藻物质基因, 阐明杀藻的分子机制。并在此基础上, 通过基因工程操作, 导入藻类去壁酶基因或其他细菌的杀藻物质基因, 构建高效的工程菌株, 应用于有害藻类水华的生物防治中。
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水华和赤潮的爆发是多种因素综合作用的结果, 经验表明, 仅靠一种治理方案往往难以取得理想效果。以菌治藻作为水华和赤潮生物防治的一个新对策, 尚需其他治理方案的配合。在生态系统良性循环的基础上以菌治藻, 才是溶藻细菌防治水华和赤潮的最佳选择。
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