张小玲;刘文清;殷高方;赵南京;覃志松;肖雪;段静波;杨瑞芳;涂梦迪;刘建国
【摘 要】离线语音识别方案蓝藻生物量检测技术发展是应对目前频繁发生的水华事件的重要环节. 藻蓝蛋白作为蓝藻的特异性蛋白,在一定程度上比叶绿素更能准确反应自然水体中的蓝藻生物量,因而成为蓝藻生物量检测技术的重要指标. 本文利用三维荧光光谱技术,以不同光照、不同生长期的铜绿微囊藻、鱼腥藻活体为研究对象,比较了单点法和包络法两种光谱解析方法的可靠性,探究了不同生境条件下的藻蓝蛋白活体荧光光谱特性. 结果表明: (1)荧光光谱强度随生长期延长而增大;(2)采用包络法解析藻蓝蛋白特征荧光光谱的方法比单点法更为可靠;(3)在不同生境条件下,铜绿微囊藻藻蓝蛋白活体荧光激发波长基本保持614 n m、发射波长基本保持654 nm不变,鱼腥藻藻蓝蛋白活体荧光激发波长随生长期在610和620 nm之间波动减小,发射波长随生长期在650和660 nm之间波动增大. 这种波动与藻种样品颗粒度大小和光谱扫描模式有关. 该研究结果为发展蓝藻生物量活体荧光监测技术发展提供了实验基础.%The development of cyanobacterial biomass detect ion technology is an important part to deal with the frequent occurrence of water bloom events.Phycocyanin,to some extent,as a special protein of cyan
oba cteria,is more accurate reaction in natural water cyanobacterial biomassthan ch lorophyll,thus become an important index in cyanobacterial biomass detection.T his paper,with different light intensity and different growth stages as the res pares the reliability of the two methods of the envelope metho d and the single point method,exploring the fluorescence spectral characterist ics of phycocyanin in vivo Microcystis Anabaena by using three-dimensional fluo rescence spectroscopy.The results show that:(1) The fluorescence intensity inc reases with the growth of long-term;(2) It is more reliable to use envelope me thod to analyze the characteristic fluorescence spectra of the fluorescent spect rum than the single point method.(3) The fluorescence spectra of Phycocyanin in vivo Microcystis were basically unchanged in EX=614 nm/ EM=654 nm.The excitati on wavelength of the phycocyanin fluorescence in vivo Microcystis decreases with the growth with 610 and 620 nm in the long term,and the emission wavelength va ried between 650 and 660 nm,which is related to the sample particle size and sp ectral scanning mode.This study provided the experimental basis for the develop ment of the fluorescent detection technology of cyanobacteria.
【期刊名称】套筒冠《光谱学与光谱分析》
【年(卷),期】2017(037)004
【总页数】7页(P1145-1151)
【关键词】藻蓝蛋白;活体荧光;蓝藻;浮游植物
【作 者】张小玲;刘文清;殷高方;赵南京;覃志松;肖雪;段静波;杨瑞芳;涂梦迪;刘建国
【作者单位】中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 2
30031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室,安徽 合肥 230031;中国科技大学,安徽 合肥 230036;安徽省环境光学监测技术重点实验室,安徽 合肥 230031
【正文语种】中 文
【中图分类】O433.4
近年来， 随着人类对环境资源开发利用活动日益增加， 大量含有氮、 磷营养物质的生活污水排入附近的湖泊、 水库和河流， 导致水华事件频繁发生， 严重地影响了饮用水的质量安全。 蓝藻门占我国常见水华藻的80%以上， 蓝藻的实时检测对了解蓝藻毒素的分布、 控制蓝藻水华产生具有相当重要的意义。 目前常用的蓝藻检测方法如镜检计数法、 分光光度法、 高效液相谱法等均存在测量过程繁琐、 预处理步骤复杂的问题， 且只能以总叶绿素a浓度指示总浮游植物生物量， 并不能分类检测蓝藻生物量。 荧光光谱法几乎不受其他微粒物质的影响， 具有无需样品预处理、 测量速度快的特点。 荧光光谱法还能获得包括总叶绿素a浓度、 藻蓝蛋白浓度等全部的素信息， 为蓝藻的现场快速分类测量提供了有利条件[1-3]。
藻蓝蛋白是蓝藻的特有素蛋白， 自然水体中的藻蓝蛋白浓度比总叶绿素浓度更能准确反映出实际的蓝藻生物量， 因而成为荧光法测量蓝藻生物量的重要目标素。 但目前针对蓝藻监测技术方面进行研究中， 对藻蓝蛋白特征荧光光谱范围选择的并不统一， 制约了蓝藻生物量荧光检测方法的发展。 如McQuaid等[4]以EX=590/EM=660 nm为活体藻蓝蛋白特征荧光波长监测了水源地的饮用水水源； 殷高方等[5]选择EX=620 nm/EM=660 nm作为藻蓝蛋白的特征荧光光谱点探究了基于素特征荧光光谱的浮游植物分类测量方法； 王志刚[
6]以EX=610/EM=660为藻蓝蛋白的最佳波长研制了水体浮游植物的原位测量系统； 王勇等[7]以EX=615/EM=652 nm研究了高纯度藻蓝蛋白的分离纯化及光谱特性， 除此之外， 还有藻蓝蛋白研究方法[8-9]， 采用了其他不同的特征波长， 制约了采用荧光光谱检测蓝藻生物量方法的发展。 鉴于此， 本文以实验室培养的铜绿微囊藻、 鱼腥藻为研究对象， 利用三维荧光光谱技术探究了不同藻种、 不同光照强度、 不同生长期的藻蓝蛋白荧光光谱特性， 旨在得出不同生境条件下藻蓝蛋白活体荧光光谱的演变规律， 此研究对于蓝藻的准确实时监测具有十分重要的意义。
1.1 藻种培养
实验选择我国蓝藻门常见的蓝藻淡水藻种： 铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和鱼腥藻(Anabeana)进行研究。 选用的藻种来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。 藻种的扩大培养在培养箱中进行， 光源使用白冷荧光灯管， 实验设置强弱光照两个对照小组， 强光照对照组的光照强度为3 000 lx， 弱光照对照小组的光强设置为300 lx， 固定光暗周期为12/12 h， 温度为25/22 ℃。 铜绿微囊藻的培养周期为40天， 鱼腥藻的培养周期为30天。
1.2 三维荧光光谱获取
柜台制作
实验测量从接种藻种后第7天开始， 每两天测量藻蓝蛋白活体荧光光谱一次。 实验使用Hitach7000荧光分光光度计分别扫描铜绿微囊藻、 鱼腥藻的三维荧光光谱。 光谱测量参数设置如下： 激发光谱范围为380～650 nm， 激发波长间隔为3 nm， 发射光谱范围为400～721 nm， 发射波长间隔为3 nm， PMT设置为450 V。 实验光谱采用Delaunay三角形内插值法[10]去除测量光谱中的瑞利和拉曼散射信号， 得到不同生境条件下的藻蓝蛋白三维荧光光谱。
2.1 藻蓝蛋白三维特征荧光光谱
实验设置四个实验组， 命名为MW， MS， AW， AS组。 分别代表： 铜绿微囊藻-弱光照生长条件、 铜绿微囊藻-强光照生长条件、 鱼腥藻-弱光照生长条件、 鱼腥藻-强光照生长条件。 为方便表述， 以下以组名代替不同生境条件讨论。
由图1可以看出， 在不同生境条件下， 活体藻蓝蛋白特征荧光峰的范围基本相同， 荧光峰的激发波长、 发射波长分别处于500～650和550～721 nm之间。 且藻蓝蛋白特征荧光峰开关柜除湿
的面积只占三维荧光光谱的一部分， 大多数区域属于无效数据区域。 因此， 实验选定的有效光谱区域为激发光谱范围为506～644 nm， 发射光谱范围为595～712 nm。 光谱区域的选择原则是： 既能最大程度的保证藻蓝蛋白特征荧光峰的信息完整性， 又能处理数据时的繁复性。
2.2 单点法探究藻蓝蛋白荧光峰演变
采用MATLAB插值算法对活体藻蓝蛋白特征荧光光谱进行处理， 得到图2所示三维荧光光谱图。 可以看出， 鱼腥藻活体藻蓝蛋白特征荧光峰为双峰或三峰， 峰形更“胖”； 铜绿微囊藻活体藻蓝蛋白特征荧光光谱为单峰， 较鱼腥藻活体藻蓝蛋白荧光峰更为稳定。 以上工作利用MATLAB 7.10.0(R2010a)版本完成。
不同对照组中活体藻蓝蛋白特征荧光峰如图2所示。 在以往的研究中， 多采用“单点法”研究藻蓝蛋白的特征荧光峰， 即分别出其最高峰值处对应的激发波长和发射波长， 通过研究峰值单点处的波长及强度变化趋势来探究藻蓝蛋白特征荧光峰的演变。
采用单点法对不同生境条件下的藻蓝蛋白活体三维荧光光谱进行解析， 结果见图3。 从图
3中可以看出在不同生长期时藻蓝蛋白激发波长只在608和620 nm之间无规律波动， 受生境条件影响不明显； 发射波长则与活体藻种有关， 铜绿微囊藻活体藻蓝蛋白在不同光照及生长期时保持发射波长为652 nm不变， 鱼腥藻活体藻蓝蛋白则基本保持发射波长664 nm不变。
由于“单点法”只需要一组特征激发/发射波长来探究藻蓝蛋白的特征荧光光谱， 此种解析方法只有峰值位置和强度信息， 对三维荧光光谱数据的利用率极低且稳定性较差， 因而通过单单采用一组数据探究藻蓝蛋白含量进而探究自然水体中蓝藻生物量方法的可靠性是不高的。 需要探究一种新的光谱解析方法来准确探究藻蓝蛋白活体荧光光谱的演变。
2.3 藻蓝蛋白光谱包络线法
所谓“包络法”是指对有效的三维特征光谱区域进行二维化处理。 具体步骤为(以发射谱包络线为例)： (1)将三维荧光光谱按照激发波长进行发射谱展开； (2)将展开的发射谱按照激发波长大小依次衔接平铺为二维序列， 平铺后横坐标为第n个光谱采样光谱点数， 纵坐标为对应的光谱强度； (3)采用一定的算法分别出每一条发射谱对应的最大强度值， 连接形成包络线， 此时横坐标表示第n个发射谱， 纵坐标表示第n个发射谱对应的光谱强度最大
值。 通过以上操作步骤得到了发射谱包络线。 采取同样的操作方法可以得到三维荧光光谱的激发谱包络线。 像这种以探究激发谱包络线和发射谱包络线的演变来代替三维荧光光谱演变的方法称之为包络线法。
led电子显示屏制作
