制备和构建抗各种呼吸道病毒感染的重大创新性Ab2β抗体库的方法

制备和构建抗各种呼吸道病毒感染的重大创新性Ab ₂β抗体库的方法

本发明涉及防治人类呼吸系统任何急性病毒性传染病的特效“新式武器″，即全部由专一阻断病毒——呼吸道靶细胞结合位点的抗体组成的、具有特殊功能和用途的“Ab₂β抗体库”的制备和构建方法(特别涉及本发明独创性免疫学实验技术)。

目前呼吸道致命性病毒，如“甲型H1N1流感、非典、禽流感”等病毒或其变异体引起的突发事件对世界各国人民造成了严重危害。其中世界著名“科学”杂志把攻克“病毒变异”做为生命科学领域首选世界难题。对此目前全世界抗病毒研究现状：①无任何特效的抗病毒药。②尚无任何有希望的抗病毒研究计划。

本发明与目前全世界抗病毒研究相比，在许多方面诸如事物整体观和认识论、多学科交叉指导理论、发明思维、研究方法、技术手段等都是截然相反的，这直接导致不同的发明原理。为使相关人士和厂家了解发明原理，本文用通俗语言阐述：由于人体呼吸道靶细胞膜表面分子空间结构和位置有限，所以任何已知或未知病毒入侵人体呼吸道靶细胞的途径都是有限的。假设任何病毒包括变异病毒入侵人体呼吸道靶细胞的全部途径共有“1千条”，那么任何特定病毒必须通过其中的1-几条途径入侵人体细胞，没有任何病毒列外。如果我们项目研究的科学目的，是在呼吸道靶细胞膜表面所有不同结构都安排相对应的抗体守卫，那么其中就包括一千个不同的抗体分别对应守卫着一千条不同病毒的入侵途径，即阻断了全部病毒入侵途径。因此任何病毒不管如何变异，都不可能避开这些不同的守卫抗体而进入人体呼吸道细胞。于是如何制备守卫呼吸道靶细胞膜表面所有不同结构(其中包括一千条不同病毒的入侵途径)的新型抗体，并且由这些抗体构建成具有特殊功能和用途的抗体库，就是本发明的目的。用通俗语言讲：就是构建一个抗呼吸道病毒的抗体库，库中有抗各种病毒的最有效抗体。对付任何急性病毒性传染病时，只需用致病病毒从抗体库中“钓取”专门与该病毒相结合的抗体，就可以最有效防治任何急性病毒性传染病。需要强调的是，本发明项目与世界上所有 抗病毒疫苗产生的抗体最大区别在于：本发明的抗体都是最有效的特异性中和抗体(不存在任何增强抗体或无效抗体)，完全是为阻断不同病毒的不同入侵途径而设计的。因此有两个举世无双的重大创造点：①制备的每一个单克隆抗体的病毒中和位点都是最有效的、原因在于中和位点的空间结构就是入侵人体呼吸道细胞的必经途径，即抗体阻断了病毒——靶细胞的结合位点。②构建包含阻断任何病毒入侵人体呼吸道靶细胞全部途径的具有特殊功能和用途的“抗体库”。该项研究看似十分困难，如果仅有正向思维或仅以传统研究方式来“求解”，则不可能完成该工程。那种经典的传统的实验方式，即把病毒或其疫苗分别免疫动物和人，然后从抗病毒血清中筛选仅抗病毒——靶细胞结合位点的中和性抗体的实验方式，是目前通用的，虽然可以间接说明本项目的可行性，但肯定是最笨的研究方法，或许100年也不可能真正获得问题“解”。本发明的设想，曾在中国医师协会网-热点新闻，以“生命科学需要高度关注一种离经叛道的思维模式”一文(3万字中的部分内容——重大抗呼吸道病毒创意)中发表，引起轰动，让网站工作人员都感到吃惊。国内外许多专业和非专业网站和大学都进行了转载，数万医师和相关人士阅读了本文，没有任何国内外权威和专家能够提出疑议，只是认为实现这一目标太难了，都希望本人能够公开更多创新内容，但因保密问题拖到现在。今天借助专利申请书，公开实验方案。

1.本发明理论依据

1.1本发明间接理论依据：

1.1.1制备专一阻断病毒入侵靶细胞途径的“最好抗体“的理论依据

1.1.1.1抗体覆盖理论

指抗体覆盖率与中和作用的相关性，如对狂犬病毒的中和，每个毒粒200个以上IgG分子，才能占据其表面结构(表位)，使之不能与靶细胞受体相互作用。而对另一个狂犬病毒中和逃逸突变株分析发现，每个毒粒结合1000以上的IgG分子，但仍然不能被中和。

1.1.1.2病毒“配体”与靶细胞“病毒受体”的相互作用理论

病毒之所以能够吸附于细胞而开始感染，其主要的结构原因是病毒表面结构蛋白的特定 位点，能够以特定的拓扑学性质与细胞表面某种受体发生相应结合，该结合使病毒有了借以进入细胞的桥梁。而在病毒感染中，机体产生的抗病毒特异性抗体之所以能够抑制病毒的再感染，一条主要原因就是有的抗体可以用特定的对应结构，与病毒表面与受体发生结合作用的位点结构产生特异结合，从而在拓扑学上阻断病毒与细胞受体的结合，因此终止了病毒对细胞的感染，这样一个自然的机理显然提供了寻病毒感染药物(注：包括化学药品)的理论基础。

1.1.1.3抗体与病毒的相互作用理论

HA蛋白是流感病毒的主要抗原之一，其头部有5个抗原位点，分别称A、B、C、D和E位点，其中B位点为靶细胞受体结合位点。在研究病毒特别是HIV-细胞间相互作用中发现，除病毒包膜“配体”与靶细胞“病毒受体”间直接接触的氨基酸残基外，其他病毒部位诱生的抗体很难界定是中和性抗体还是非中和性抗体或增强性抗体，原因在于：①能被中和的病毒毒株可突变为对同一抗体具有抗性或被此抗体增强的毒株。②用某一毒株免疫个体产生的抗体可能对该毒株是中和抗体但对其他毒株是增强抗体。③明确只诱导中和抗体而不诱导增强抗体的病毒包膜区是很困难的。最终病毒与抗体相互作用的结果要取决于产生中和性抗体与增强性抗体之比，即两者对病毒总体作用的“净”效应。

1.1.1.4结论：抗体中和病毒的关键，是需要好中和病毒的位置(作用点)，而最好的位置就是病毒——靶细胞的结合部位，即病毒“配体”的结合位点，而针对病毒“配体”结合位点的抗体就是最好的抗体。

1.1.2构建具有特殊功能和用途“抗体库”的理论依据：

1.1.2、1病毒或其变异体入侵人体呼吸道细胞的全部途径

任何已知或未知的病毒变异如流感病毒血凝素蛋白上一个氨基酸残基的变化，就可以使病毒与所结合的唾液酸受体类型发生变化。这种变化的实质就是增加入侵呼吸道细胞的新途径，特别指出这种新途径都必须是通过靶细胞表面相对应的“病毒受体”完成的，而“病毒受体”又是呼吸道靶细胞表面已知或未知的膜蛋白分子，(蛋白质组分)。正由于各种不同类 型的“病毒受体”在呼吸道靶细胞表面的数量是有限的，所以病毒入侵呼吸道的途径也是有限的，因此可以说任何病毒通过变异产生的新途径都隐藏在这些“病毒受体”中。本项目预期产品——构建具有特殊功能和用途的’抗体库″，其抗体克隆数量包括对应病毒入侵靶细胞全部可能或潜在的入侵途径，这就是本发明项目的大框架。

1.1.2.2结论：构建阻断病毒入侵呼吸道全部途径的抗体库，可能提供了一种解决未知病毒或变异病毒世界难题的最好途径。

1.2本发明的直接理论依据：

1.2.1病毒配体——靶细胞“受体”相互作用理论

实验证明，病毒感染细胞的前提是与细胞表面的受体相结合，这个结合在反映与结构蛋白的空间构象与受体空间构象之间的生物化学意义上的配构关系之外，在生物意义上则反映了病毒的组织和细胞特异嗜性的现象。如果病毒不能进入细胞，或被阻止于吸附细胞受体之前，则病毒对宿主细胞的影响是极小的，而对病毒——细胞受体的研究正好提供了这样一种可能。仅对本发明而言，正是这样的一种类似正常生理配体与受体结合的细胞生物效应导致病毒进入细胞。

1.2.2抗体独特型与抗独特型抗体模拟抗原理论

数字庞大的Id或AId抗体可以摸拟整个外来抗原世界，这是构建“Ab₂β抗体库”的主要理论基础。利用这一理论，特别是通过创造性应用相关理论和免疫学实验技术，就可以制备模拟靶细胞膜表面全部分子的易接触的空间结构，其中包括模拟全部病毒受体的抗体。另外，不管病毒抗原如何千变万化，活的细胞表面病毒受体是不变的，因此本发明模拟靶细胞病毒受体的抗体，就能以“抗体的不变应对病毒抗原的万变”。而且本发明理论上推测，这种抗体本身还可能或多或少预留着可以结合病毒变异氨基酸残基所需的空间位置。

1.2.3多态性MHC免疫识别理论

多态性MHC的生物学功能和意义，决定了不同品系动物特别是某些品系动物具有更广和更深的免疫识别功能，应用多态性MHC免疫识别理论，同样是为最大限度增加对呼吸道上皮细胞 膜表面全部分子易接触空间结构的免疫识别，并以此制备模拟靶细胞全部“潜在病毒受体”的抗体，构建Ab₂β抗体库。多态性MHC免疫识别理论同样是构建“Ab₂β抗体库”的重要理论基础。

本发明从病毒配体——靶细胞“受体”相互作用理论和抗体独特型与抗独特型抗体模拟抗原理论中导出如下重要结论：①抗靶细胞“病毒受体”的抗体，就是模拟病毒配体的抗体；抗病毒配体的抗体，就是模拟靶细胞“病毒受体”的抗体。②病毒组织嗜性，即组织特异性，决定了呼吸系统主要靶细胞——上皮细胞为本发明的研究对象。本发明采用独创性免疫学和细胞生物学技术，首先应用呼吸道病毒重要靶细胞——上皮细胞分别免疫大量不同动物，制备抗上皮细胞膜表面不同蛋白分子不同抗原决定簇的抗体。然后再利用这些抗体，制备能够模拟上皮细胞不同蛋白分子不同表位(注：其中包含潜在病毒受体)的抗体，这就是能够专一阻断任何病毒——靶细胞全部结合位点的抗体。最后由所有这种抗体组成具有特殊功能和用途的“Ab₂β抗体库”。这样就可以随时从库中筛选针对任何引起呼吸系统急性传染病的病毒(包括未知病毒)或其变异体的特异性中和抗体了。

2.实验方案

2.1第一个实验方案：

2.1.1全方位抗呼吸道靶细胞膜表面不同表位抗体(Ab1抗体)的制备：应用人呼吸道完好上皮细胞或相应癌细胞，分别免疫大量不同品系的兔子和小鼠，从中提取不同品系兔子和小鼠的抗人血清，然后用人呼吸道上皮细胞吸收其中抗体，并用新方法洗脱、提取和纯化这些抗体，本发明把这种抗体称“Ab1抗体”.

2.1.2专一筛选结合“Ab1抗体”抗原结合位点的B细胞：①应用常规免疫学实验技术，分别提取纯化大量不同人和不同品系兔子的B细胞。②通过本发明非常简单的、独创性免疫学新试验技术，巧妙处理上述试验获得的人、兔子的B细胞和2.1.1试验获得的“Ab1抗体”，解决B细胞与“Ab1抗体”两者之间的相互作用关系问题，即从这些B细细中完全清除掉与“Ab1抗体”本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的B细胞，目的是保留其它剩余的与本发明相关 的B细胞。③将保留的与本发明相关的B细胞与2.1.1试验获得的“Ab1抗体”混合，再通过流式细胞术(FCM)，筛选出专一结合“Ab1抗体”抗原结合部位的B细胞，即本发明所需的“Ab₂β抗体”产生细胞。特别说明的是“Ab1抗体”本身既是抗体又是抗原，注意本试验的关键在于“Ab1抗体”的抗原结合部位是作为唯一抗原结合BCR--B细胞的，在免役学理论与实际结合中不能忘记这一点，否则不能理解本试验——如何专一筛选出结合“Ab1抗体”抗原结合部位的B细胞。

2.1.3构建具有特殊功能和用途的初级“Ab₂β抗体库″：将能够与Ab1抗体抗原结合部位结合的B细胞进行体外培养，在特定的不同时间内，通过2个途径：①将体外培养的B细胞，通过噬菌体抗体库技术制备噬菌体“Ab₂β抗体”。②通过体外培养B细胞技术获得分泌性“Ab₂β抗体”。尽可能获得模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同蛋白分子不同表位(注：其中包含潜在病毒受体)的全部“Ab₂β抗体″，并以此构建初级“Ab₂β抗体库″

2.1.4验证初级“Ab₂β抗体库″的功能和效果：利用特定病毒或减毒活疫苗等从初级“Ab₂β抗体库″中筛选抗体，提取和纯化专一抗特定呼吸道病毒-靶细胞结合位点的抗体，即模拟靶细胞“病毒受体”的Ab₂β抗体，以此检验初级“Ab₂β抗体库″的功能和效果。

2.1.5病毒中和试验：利用某些已知病毒或减毒活疫苗等从“Ab₂β抗体库″中筛选特异性抗体，并进行病毒中和实验，确证“Ab₂β抗体”的功能和效果，制备针对某些已知特定病毒的特异性中和抗体(特异性免疫球蛋白)，构建具有特殊功能和用途的“Ab₂β抗体库″。

2.1.6附图是该实验方案的技术路线图。

2.2第二个实验方案：

2.2.1全方位抗呼吸道靶细胞膜表面不同表位抗体(Ab1抗体)的制备：应用人呼吸道完好上皮细胞或相应癌细胞，分别免疫大量不同品系的兔子和小鼠，从中提取不同品系兔子和小鼠的抗人血清，然后用人呼吸道上皮细胞吸收其中抗体，并用新方法洗脱、提取和纯化这些抗体，本发明把这种抗体称“Ab1抗体”。

2.2.2专一筛选结合“Ab1抗体″抗原结合位点的噬菌体“Ab₂β抗体”，构建初级噬菌体“Ab₂β抗体库”：利用市场现成商品——噬菌体抗体库，并通过噬菌体抗体库筛选技术，专 一筛选结合“Ab1抗体”抗原结合位点的噬菌体“Ab₂β抗体”，该试验过程需两步骤：①采用本发明独创性筛选技术，清除掉与“Ab1抗体”本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的噬菌体抗体，目的是保留其它与本发明相关的噬菌体抗体。②采用经典筛选方法，利用“Ab1抗体”本身的抗原结合部位作为唯一抗原，从保留的与本发明相关的噬菌体抗体中，专一筛选出结合该部位的噬菌体“Ab₂β抗体”，并以此构建初级噬菌体“Ab₂β抗体库”。

2.2.3验证初级噬菌体“Ab₂β抗体库″的功能和效果：利用特定病毒或减毒活疫苗等从初级噬菌体“Ab₂β抗体库″中筛选抗体，提取和纯化专一抗特定呼吸道病毒-靶细胞结合位点的特异性噬菌体抗体，即模拟靶细胞“病毒受体”的Ab₂β抗体，以此检验初级噬菌体“Ab₂β抗体库”的功能和效果。

2.2.4病毒中和试验：利用某些已知病毒或减毒活疫苗等从初级噬菌体“Ab₂β抗体库″中筛选特异性噬菌体抗体，并进行病毒中和试验，确证噬菌体“Ab₂β抗体”的功能和效果。制备针对某些已知特定病毒的特异性中和抗体(特异性免疫球蛋白)，构建具有特殊功能和用途的噬菌体“Ab₂β抗体库″。

2.3备注：

2.3.1本发明只采用第一个实验方案，该实验方案检测抗不同病毒的确证试验越成功，说明“Ab₂β抗体库”的构建越完善，客观讲“Ab₂β抗体库”的构建不会有失败，只有不断完善。

2.3.2由于第二个实验方案成功率相对较低，本发明不采用，因此也没有标出相应技术路线图。只是因为预见到有这样一种实验方法，为保护本发明，特在本发明中阐述出来。

3.预期实验两年和预算经费

3.1第一年，初步构建一个具有特殊功能和用途的人源及兔子源的“Ab₂β抗体库”，可有一定效果的从抗体库中提取针对某特定病毒的特异性抗体。所需经费80-100万人民币。

3.2第二年，进一步完善上述“Ab₂β抗体库”。利用某些已知的呼吸道病毒或减毒活疫苗等从抗体库中筛选特异性抗体，并进行病毒中和实验，确证抗体的功能和效果，并制备针对特定病毒的特异性中和抗体(特异性免疫球蛋白)以备用，同时构建针对某些已知呼吸道病 毒的“特异性Ab₂β抗体库”。所需经费90-110万人民币。

4.证明本发明项目可行性的重要预试验

在具有免疫学常规实验条件和熟练科研试验人员情况下，只需15万人民币的预试验，在1个月时间内就可检测和验证本发明在技术上是否具有可行性的问题。如在1个月时间内，以不同生物公司购买的动物源抗人CD4分子单克隆抗体作为抗原材料，通过本发明独创的免疫学试验技术，筛选专一结合CD4单抗本身抗原结合部位的BCR——B细胞，并以此获得抗CD4分子的抗抗体-Ab₂β抗体。这一试验过程就是证明本发明项目可行性的重要预试验。有趣的是这种特别挑选的预试验，其本身价值就与制备专一阻断艾滋病毒感染途径的超级抗体有关。如果预试验成功除说明本发明项目可行外，在生物医学上还有其他重要战略意义。本发明声明仅一个预试验本身就有重要用途和意义。

5.预期成果——本发明项目的重要用途和意义

众所周知“非典”时期，北京某著名军医利用广东感染SARS病毒痊愈患者的抗病毒血清自救获得新生的故事，本发明项目预期产品-特异性免疫球蛋白，比之上述抗病毒血清强百倍、千倍。与人感染病毒或接种了疫苗后提取的抗病毒血清相比，克服了抗病毒血清存在的四大问题：①安全性问题，抗病毒血清中可能存在病毒，由此可能增加受者感染病毒的机会，并由于同种异体血清中存在众多物质也可能会给受者带来过敏反应。②有效性问题，抗病毒血清中的抗病毒抗体是不纯的，而且由于不同个体存在不同的免疫应答格局的原因，病毒或疫苗在宿主体内产生的抗体有“好”抗体和“坏”抗体之分，而真正抗病毒作用取决于“好”抗体与“坏”抗体两者作用的“净”效应。③抗原“原罪”问题，这一问题很重要，即感染某一特定病毒或接种了某一特定病毒的疫苗后，再次接触感染了该特定病毒的“变异体”(病毒变异了)后，很可能某些个体对变异病毒不产生免疫应答，如果出现这种免疫延迟现象真不如当初不接种疫苗，因此疫苗接种是有原则和条件的。④从具有特殊功能和用途的“抗体库”筛选和大量制备特异性抗病毒抗体，体现了多、快、好和省的原则，可以快捷有效特别是防治任何呼吸道病毒引起的突发事件，这是任何病毒疫苗和抗病毒血清无法做到 的、也是任何抗病毒物质包括化学药品所不能做到的。

5.1本发明项目预期产品-“Ab₂β抗体库”可在最短时间提供大量最有效抗体，防治人类呼吸系统的任何急性病毒性传染病。特别是如H1N1流感、禽流感、SARS或生物武器等致命性疾病引起的突发事件。

5.2应用从“Ab₂β抗体库”中筛选的特异性抗病毒抗体，制备抗体芯片。

5.3本发明独创性技术还特别与制备双重阻断艾滋病毒感染的超级抗体有关，如制备模拟HIV主要靶分子——CD4和SIGN“病毒受体”的Ab₂β抗体，甚至应用抗癌领域制备专一杀伤癌细胞的高精准性CTL抗癌细胞(注：前所未有的从多态性MHC体提取的大量不同克隆的CTL细胞中进行筛选，)有关。

5.4制备抗体疫苗等如以痘苗天坛株为载体的基因工程疫苗。

5.5“Ab₂β抗体库”可以防治生物武器或基因靶向性武器对特定人种的攻击。

5.6本发明独创的免疫学试验技术，可以有的放矢地促进病毒——靶细胞间“配体和受体”的研究如两者相互作用关系和作用规律以及空间结构。另外也会促进正常生理配体与受体结合的细胞生物学研究。

5.7最后特别指出：本发明独创的免疫学试验技术，在生命科学领域为高分辨任何物质间微细差异提供了一个重要方法。

由于本发明保密原因而且投入经费不多，故不申请地方和国家科研经费。本发明人不为钱，只为做一番事业。欢迎想做一番轰轰烈烈事业的各行各业有识之士和任何商家厂家与我合作(如需要我可以提供有实力科研单位合作)，让我们共创举世伟业，震惊世界吧！