基于AuNPs/HRP/FeMOF协同的唾液中Cyfra21-1检测试剂盒及应用

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基于aunps/hrp/femof协同的唾液中cyfra21-1检测试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于纳米生物传感以及生物检测技术领域，具体涉及一种基于aunps/hrp/femof协同的唾液中cyfra21-1检测试剂盒及应用。

背景技术：

2.口腔鳞状细胞癌对人类健康构成了严重的威胁，口腔鳞状细胞癌与口腔微环境严格相关，其与唾液直接接触，当口腔内黏膜细胞发生癌变时，癌细胞将释放大量cyfra21-1到细胞外，表现为唾液中cyfra21-1异常升高。因此唾液中的cyfra21-1可作为口腔鳞状细胞癌早期诊断的辅助标志物。
3.目前，已经开发了多种方法来测量口腔中的口腔鳞状细胞癌，例如组织学检查、激光显微捕获切割技术、细胞病理学及活体检测。然而，上述分析技术一般都会侵害人体，且耗时久、成本高，因此其应用受到一定局限。因此，需要寻一种能快速简单且经济实用的检测试剂。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于aunps/hrp/femof协同的唾液中cyfra21-1检测试剂盒及应用。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于aunps/hrp/femof协同的唾液中cyfra21-1检测试剂盒，包括如下物质：包被后96孔聚苯乙烯微孔板、aunps/hrp/femof溶液、pbst溶液和tmb显液；
6.所述包被后96孔聚苯乙烯微孔板是：用ph9.6的碳酸盐缓冲液将cyfra21-1包被抗体稀释至2.84μg/ml，然后用移液吸取稀释后抗体至96孔板，每孔包被量为100μl，在4℃下静置12小时；用pbst洗涤液洗涤多孔板4次，然后用质量分数为2％的bsa溶液封闭空余结合位点，每孔200μl，在37℃下静置2小时；用pbst洗涤液洗涤多孔板4次后所得；
7.所述aunps/hrp/femof溶液是：将0.1mk2co3溶液加入0.05mg/mlaunps溶液中，体积比为1：67，向混合溶液中加入8μl10μg/mlhrp溶液，在25℃下混合2小时；所获得的溶液与等体积0.001g/mlfemof溶液在25℃下混合4小时；取反应后的溶液在14000rpm转速下离心5分钟；将沉淀用1mmpbs润洗，重复3次；取润洗后的沉淀溶解在1mmpbs中；然后再加入等体积的质量分数为5％的bsa溶液，混合2小时；取反应后的溶液在14000rpm转速下离心5分钟；将沉淀用1mmpbs润洗，重复3次，取离心后的沉淀溶解在1mmpbs中；
8.所述hrp溶液是：用hrp修饰的cyfra21-1检测抗体溶液；
9.所述pbst溶液是：0.01mpbs和质量分数为0.01％tween-20的混合溶液。
10.所述tmb显液是：用10mmph4.0醋酸/醋酸钠缓冲液稀释后的100mmh2o2和tmb的等体积混合溶液。
11.进一步地，具体检测过程为：取50μl唾液样本溶液和50μlaunps/hrp/femof溶液
h2o2和tmb的等体积混合溶液。
27.上述基于aunps/hrp/femof协同作用的唾液中cyfra21-1检测试剂盒，具体检测过程为：取50μl唾液样本溶液和50μl aunps/hrp/femof溶液加入到包被后96孔聚苯乙烯微孔板中。反应1小时后用pbst洗涤液洗板4次后，在反应后的溶液中加入100μl tmb显液反应15分钟，将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长650nm处的吸光度，根据吸光度的结果判断唾液样本溶液中cyfra21-1含量。
28.aunps，hrp和femof之间通过化学键结合与静电吸附作用结合，不需要复杂的合成操作。其中aunps的高比表面积和femof的高孔隙率提高了hrp 的吸附量且增加了hrp的稳定性。aunps与femof的过氧化物酶催化活性协同hrp可以实现级联信号放大作用。
29.实施例1：
30.aunps制备：将制备所用的所有玻璃器皿用王水浸泡3h，超声清洗后再用超纯水冲洗三遍，干燥后备用。将100ml 0.01％(v/v)的氯金酸溶液加热至沸腾，高速搅拌条件下快速加入5ml 1％(v/v)的柠檬酸三钠，继续加热搅拌30min，溶液由无变为蓝紫最后变为酒红，自然冷却至室温后放在4℃ 冰箱中避光保存备用。如图2所示，将制备好的aunps用tem进行表征，其粒径在15nm左右。
31.实施例2：
32.femof制备：通过热溶剂法进行制备，具体过程为：将0.122g六水合氯化铁和0.382g对苯二甲酸在剧烈搅拌下溶解在30ml dmf中，将所得溶液加入到聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在110℃下加热20小时。冷却至室温后，进行洗涤过滤，将过滤所得的粉末用乙醇煮沸加热进行活化12小时，并在真空情况下干燥12小时得到femof粉末。如图3所示，将制备好的femof用 tem进行表征，其形状为八面体形状。
33.实施例3：
34.aunps/femof制备：向1ml 0.001g/ml femof溶液加入200μl 10mm ph 4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液。所获得的溶液与aunps溶液等体积混合6小时。取反应后的溶液在14000rpm转速下离心5分钟。将沉淀用纯水润洗，重复3次。取离心后的沉淀溶解在2ml纯水中。如图4所示，将制备好的aunps/femof 用tem进行表征，可清楚的看到aunps成功的结合到femof上。
35.实施例4：
36.aunps、hrp和femof的协同催化活性：向制备好的femof溶液中加入 10μg/ml hrp，体积比为2：1，混合6小时。取反应后的溶液在14000rpm 转速下离心5分钟。将沉淀用1mm pbs润洗，重复3次。取离心后的沉淀溶解在1ml 1mm pbs中获得femof/hrp溶液。取制备好的femof， aunps/femof和femof/hrp溶液。设置扫谱范围为300nm-700nm，选择要扫谱的区域，进行吸光度谱扫描，如图5所示。扫谱结果表明，出峰位置在波长375nm和650nm处，验证了femof，aunps和hrp均可以使tmb显液显，具有h2o2催化活性。且femof与aunps以及hrp的结合是成功的，可以显著提升催化性能。
37.实施例5：
38.aunps/hrp的结合性验证：将0.1m k2co3溶液加入0.05mg/ml aunps溶液中，体积比为1：67。向上述混合溶液中加入8μl 10μg/ml hrp溶液，在25℃ 下混合2小时。取反应后的溶液在14000rpm转速下离心5分钟。将沉淀用1mmpbs润洗，重复3次。取离心后的沉淀溶
解在1ml 1mm pbs中。向上述混合溶液中加入等体积的质量分数为5％的bsa溶液，混合2小时。取反应后的溶液在14000rpm转速下离心5分钟。将沉淀用1mm pbs润洗，重复3次，取离心后的沉淀溶解在1ml 1mm pbs中。图6显示了aunps在与cyfra21-1抗体结合前后的吸收光谱曲线。吸收光谱曲线发生的5nm偏移说明了aunps与 cyfra21-1抗体的成功结合。
39.实施例6：
40.cyfra21-1检测过程：取50μl cyfra21-1标准溶液和50μl aunps/hrp/femof 溶液加入到包被后96孔聚苯乙烯微孔板中。反应1小时后用pbst洗涤液洗板 4次后，在反应后的溶液中加入100μl tmb显液反应15分钟，将反应好的 96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长650nm处的吸光度。吸光度值如图7所示。传感器在7.5μg/l至250μg/l的浓度范围内表现出良好的线性。线性关系式为a＝0.283logc+0.037，线性度为0.995。显示出了非常好的灵敏度。
41.实施例7：
42.临床口腔癌患者唾液样本检测：唾液样本取自浙江大学医学院附属邵逸夫医院。将唾液样本进行14000rpm离心15分钟后进行过滤。取50μl上述临床唾液样本溶液和50μl aunps/hrp/femof溶液加入到包被后96孔聚苯乙烯微孔板中。反应1小时后用pbst洗涤液洗板4次后，在反应后的溶液中加入100μl tmb 显液反应15分钟，将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长650nm处的吸光度。代入实施6例中的线性方程式，得到cyfra21-1的浓度。如图8所示，该试剂盒检测结果与商用仪器检测结果进行比较。得出该检测试剂盒检测结果准确。
43.需要声明的是，本发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种基于aunps/hrp/femof协同的唾液中cyfra21-1检测试剂盒，其特征在于，包括如下物质：包被后96孔聚苯乙烯微孔板、aunps/hrp/femof溶液、pbst溶液和tmb显液；所述包被后96孔聚苯乙烯微孔板是：用ph 9.6的碳酸盐缓冲液将cyfra21-1包被抗体稀释至2.84μg/ml，然后用移液吸取稀释后抗体至96孔板，每孔包被量为100μl，在4℃下静置12小时；用pbst洗涤液洗涤多孔板4次，然后用质量分数为2％的bsa溶液封闭空余结合位点，每孔200μl，在37℃下静置2小时；用pbst洗涤液洗涤多孔板4次后所得；所述aunps/hrp/femof溶液是：将0.1m k2co3溶液加入0.05mg/ml aunps溶液中，体积比为1：67，向混合溶液中加入8μl 10μg/ml hrp溶液，在25℃下混合2小时；所获得的溶液与等体积0.001g/ml femof溶液在25℃下混合4小时；取反应后的溶液在14000rpm转速下离心5分钟；将沉淀用1mm pbs润洗，重复3次；取润洗后的沉淀溶解在1mm pbs中；然后再加入等体积的质量分数为5％的bsa溶液，混合2小时；取反应后的溶液在14000rpm转速下离心5分钟；将沉淀用1mm pbs润洗，重复3次，取离心后的沉淀溶解在1mm pbs中；所述hrp溶液是：用hrp修饰的cyfra21-1检测抗体溶液；所述pbst溶液是：0.01m pbs和质量分数为0.01％tween-20的混合溶液。所述tmb显液是：用10mm ph 4.0醋酸/醋酸钠缓冲液稀释后的100mm h2o2和tmb的等体积混合溶液。2.根据权利要求1所述的基于aunps/hrp/femof协同的唾液中cyfra21-1检测试剂盒，其特征在于，具体检测过程为：取50μl唾液样本溶液和50μlaunps/hrp/femof溶液加入到包被后96孔聚苯乙烯微孔板中；反应1小时后用pbst洗涤液洗板4次后，在反应后的溶液中加入100μl tmb显液反应15分钟，将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长650nm处的吸光度，根据吸光度的结果判断唾液样本溶液中cyfra21-1含量。3.一种基于权利要求1所述的唾液中cyfra21-1检测试剂盒的应用，其特征在于，所述cyfra21-1为唾液cyfra21-1，aunps/hrp/femof的制备方法依据aunps，hrp和femof之间的化学键结合与静电吸附作用；aunps与femof的过氧化物酶催化活性协同hrp实现级联信号放大作用，能够实现唾液中cyfra21-1的检测。

技术总结

本发明公开了一种基于AuNPs/HRP/FeMOF协同的唾液中Cyfra21-1检测试剂盒及应用，该试剂盒包括如下物质：包被后96孔聚苯乙烯微孔板、AuNPs/HRP/FeMOF溶液、PBST溶液和TMB显液。取50μl样本溶液和50μlFeMOF/AuNPs/HRP@Ab溶液加入到包被后96孔聚苯乙烯微孔板中。反应1小时后用PBST溶液洗板4次后，在反应后的溶液中加入100μL TMB显液反应15分钟，将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长650nm处的吸光度。本发明利用FeMOF和AuNPs对抗体的高结合力以及过氧化物酶催化活性和HRP结合进行级联信号放大，通过加入显液对Cyfra21-1进行定量检测。本发明试剂盒的检测下限低，操作简单，保存时间长。保存时间长。保存时间长。