SIRT4在肝缺血疾病中的应用

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sirt4在肝缺血疾病中的应用
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，具体涉及sirt4在肝缺血疾病中的应用。

背景技术：

2.肝脏的缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,iri）是因肝移植、肝切除等原因导致肝脏缺血，当再灌注恢复血供后，出现肝细胞功能障碍和结构损伤加重的现象。肝脏缺血再灌注损伤是影响肝移植患者预后的主要因素之一，可导致肝移植术后早期移植物功能不良、原发性移植物无功能以及急慢性排斥反应等并发症，严重的肝脏缺血再灌注损伤可进一步诱发包括炎症反应综合征和多器官功能障碍在内的全身性疾病。此外，随着我国经济发展以及等待肝移植患者人数的激增，边缘性供肝（如心死亡供肝、老年供肝、脂肪肝供肝）成为缓解肝移植供肝短缺的重要来源，但对缺血再灌注损伤的敏感性严重限制了这些器官的应用。因此，深入探索肝脏缺血再灌注损伤的发病机制，进而发现肝脏缺血再灌注损伤防治的新思路、新靶点，具有重要的研究意义和临床价值。
3.肝脏缺血再灌注损伤是一个多因素、多种信号通路共同参与的病理生理过程，其发病机制至今尚未完全阐明。目前，国内外研究一致认为肝脏缺血再灌注损伤分为缺血和再灌注两个典型的阶段，具有独特的组织损伤机制。在缺血阶段随着atp的可用性降低，atp依赖的离子通道开始失效，细胞代谢率下降，无氧糖酵解激活，肝细胞迅速死亡。再灌注损伤涉及直接和间接的细胞毒性机制，在此阶段肝脏产生活性氧刺激炎症反应，包括巨噬细胞和中性粒细胞浸润和细胞因子的产生，最终造成肝细胞凋亡、坏死。所以，过度的炎症和广泛的细胞凋亡是肝脏缺血再灌注损伤过程中的两个重要因素。
4.从上世纪80年代开始，全球学者开始寻能减轻肝脏缺血再灌注损伤的途径和方法，包括外科干预的缺血预处理、缺血后处理，以及药物预处理等，但这些方法目前均尚未取得确切的临床效果。目前分子生物学和基因工程技术等领域的快速发展，为发现针对肝脏缺血再灌注损伤相关重要功能基因的靶向开辟了新途径。
5.作为sirt家族成员之一，去乙酰化酶4（sirtuins，sirt4）主要参与调节谷氨酰胺分解代谢。和主要作为赖氨酸去乙酰化酶的sirt1-3和sirt7不同，sirt4既可以作为adp-核糖转移酶调控能量代谢，也可作为赖氨酸去乙酰化酶调控蛋白质的乙酰化修饰。作为细胞环境适应性反应的介质，sirt4在调节氧化应激方面引起广泛的关注。chen h等发现sirt4通过抑制ros产生调节大鼠牙乳头细胞分化。此外，sirt4在脂质过氧化中发挥重要作用，sirt4过表达能够显著抑制肝脏脂肪酸氧化速率。另有研究报道sirt4是调控机体免疫的关键分子，其可通过抑制炎症反应减轻非酒精性脂肪肝。然而，作为调控炎症和氧化应激的关键分子，sirt4在肝脏缺血再灌注损伤过程中的作用尚未有研究报道。由于炎症反应及氧化应激和肝脏缺血再灌注损伤的发病机制密切相关，阐明sirt4在肝脏缺血再灌注损伤发病过程中的功能作用，有望使其成为肝脏缺血再灌注损伤的一个重要潜在靶点。

技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供sirt4在肝缺血疾病中的应用。
7.基于上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明第一方面提供了sirt4作为筛选预防、缓解或/和肝缺血疾病药物的药物靶标的应用。
8.优选地，所述肝缺血疾病是由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病。
9.本发明第二方面提供了sirt4在制备预防、缓解和/或肝缺血疾病药物中的应用。
10.优选地，所述肝缺血疾病是由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病。
11.本发明第三方面提供了一种预防、缓解和/或肝缺血疾病药物，所述药物中含有sirt4激动剂、sirt4基因或sirt4蛋白。
12.优选地，所述sirt4激动剂为靶向增强或增加sirt4表达的小分子、抗体或协同性核酸。
13.优选地，所述肝缺血疾病是由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病。
14.优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：（1）本发明首次提出sirt4基因在制备肝缺血疾病药物中的用途，特别是sirt4基因作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。其中，sirt4基因在肝脏缺血再灌注损伤的药物筛选中具有如下应用：1）sirt4基因可作为诊治肝脏缺血再灌注损伤的药物靶点，构建sirt4基因高表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选诊断和/或肝脏缺血再灌注损伤的药物；2）利用体外细胞模型或动物模型，以sirt4为靶点设计小分子化合物特异性激动剂，从而为肝脏缺血再灌注损伤的提供新的性分子。本发明从动物水平用sirt4基因敲除小鼠和sirt4基因高表达小鼠验证sirt4基因在肝脏缺血再灌注损伤模型中的作用，方法真实可靠，为临床上由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病提供新的用药途径。
16.（2）本发明以sirt4基因敲除小鼠、肝细胞特异性sirt4基因高表达小鼠及与野生型c57小鼠为实验对象，通过肝缺血再灌注损伤模型研究sirt4基因在肝脏缺血再灌注中的作用。在其中一项实施例中，与对照组小鼠对比，sirt4基因敲除小鼠肝缺血再灌注后血清转氨酶（alt/ast）显著升高，肝脏坏死面积、坏死程度及炎症反应明显加重；而腺相关病毒（aav）介导的肝细胞特异性sirt4基因高表达小鼠的转氨酶（alt/ast）显著降低，肝脏坏死面积、坏死程度及炎症反应明显减轻。这提示sirt4基因在肝脏缺血再灌注中，具有抑制肝脏坏死及炎症反应、保护肝功能的作用，为sirt4在研究防治肝缺血的新靶点和新策略中所发挥的作用提供了理论依据和临床基础。
附图说明
17.图1为本发明实施例中western blot检测小鼠肝脏和肝细胞缺血再灌注损伤后sirt4蛋白表达示意图；其中，a为小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中sirt4蛋白的表达水平，b为肝细胞缺血再灌注损伤后肝细胞中sirt4蛋白的表达水平，gapdh为内参对照；
图2为本发明实施例中sirt4基因敲除小鼠构建过程示意图；图3为本发明实施例中western blot检测sirt4基因敲除小鼠和sirt4基因高表达小鼠肝组织中sirt4蛋白表达量示意图；其中，a为sirt4基因敲除小鼠肝组织中sirt4蛋白表达水平，b为sirt4基因高表达小鼠肝组织中sirt4蛋白表达水平，wt：野生型小鼠，ko：sirt4基因敲除小鼠，aav-gfp：空载病毒对照，aav-sirt4：sirt4基因高表达小鼠，gapdh为内参对照；图4为本发明实施例中sirt4基因敲除小鼠和sirt4基因高表达小鼠肝脏缺血再灌注损伤后血清中转氨酶（alt/ast）水平统计柱状图；其中，a为sirt4基因敲除小鼠血清中转氨酶（alt/ast）水平统计柱状图，b为sirt4基因高表达小鼠血清中转氨酶（alt/ast）水平统计柱状图，wt：野生型小鼠，ko：sirt4基因敲除小鼠，aav-gfp：空载病毒对照，aav-sirt4：sirt4基因高表达小鼠，sham：假手术组，iri：小鼠肝脏缺血再灌注损伤手术组，n.s.：p＞0.05，**：p＜0.01；图5为本发明实施例中sirt4基因敲除小鼠和sirt4基因高表达小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织切片he染病理图；其中，a为sirt4基因敲除小鼠肝组织切片he染病理图，b为sirt4基因高表达小鼠肝组织切片he染病理图，wt：野生型小鼠，ko：sirt4基因敲除小鼠，aav-gfp：空载病毒对照，aav-sirt4：sirt4基因高表达小鼠，sham：假手术组，iri：小鼠肝脏缺血再灌注损伤手术组；图6为本发明实施例中sirt4基因敲除小鼠和sirt4基因高表达小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织细胞中炎症细胞因子il-1β、il-6、cxcl10、tnfα表达水平示意图；其中，a为sirt4基因敲除小鼠肝组织细胞中炎症细胞因子il-1β、il-6、cxcl10、tnfα表达水平示意图，b为sirt4基因高表达小鼠肝组织细胞中炎症细胞因子il-1β、il-6、cxcl10、tnfα表达水平示意图，wt：野生型小鼠，ko：sirt4基因敲除小鼠，aav-gfp：空载病毒对照，aav-sirt4：sirt4基因高表达小鼠，sham：假手术组，iri：小鼠肝脏缺血再灌注损伤手术组，n.s.：p＞0.05，**：p＜0.01；图7为本发明实施例中sirt4基因敲除小鼠和sirt4基因高表达小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织免疫荧光染结果示意图；其中a为sirt4基因敲除小鼠肝组织免疫荧光染结果示意图，b为sirt4基因高表达小鼠肝组织免疫荧光染结果示意图，wt：野生型小鼠，ko：sirt4基因敲除小鼠，aav-gfp：空载病毒对照，aav-sirt4：sirt4基因高表达小鼠，sham：假手术组，iri：小鼠肝脏缺血再灌注损伤手术组。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例结合附图，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
19.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本技术。
20.实验动物：选用雄性c57bl/6品系，8-10周龄、体重在23-26g的野生型小鼠（wt，购自北京维通利华实验动物技术有限公司）、sirt4基因敲除小鼠（sirt4-ko，购自赛业（苏州）生物科技有限公司）及腺相关病毒（aav）介导的sirt4基因高表达小鼠（aav-sirt4，aav购自
汉恒生物科技（上海）有限公司）为实验对象。
21.饲养环境及条件：饲养环境：所有实验小鼠均饲养在郑州大学spf级实验动物中心。小鼠饲料购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
22.饲养条件：小鼠饲养在明暗交替照明时间为12h，湿度为40%-70%，室温为22-24℃的环境内，而且小鼠在饲养期间自由饮水摄食。
23.实施例1：构建肝脏缺血再灌注损伤动物模型和细胞模型1.1构建小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型1.1.1实验分组采用随机数字表法将小鼠分为5组（每组6个重复对照）：假手术组（sham组）、缺血60min再灌注3 h组（iri 3h组）、缺血60min再灌注6 h组（iri 6h组）、缺血60min再灌注12 h组（iri 12h组）、缺血60min再灌注24 h组（iri 24h组）。
24.1.1.2实验过程小鼠术前12h禁食，自由饮水。腹腔以80 mg/kg的剂量注射1%钠（sigma aldrich，p3761）麻醉小鼠，记录小鼠麻醉时间及麻醉状态。用棉签浸泡碘伏后消毒小鼠腹部后取腹部正中切口，探查肝脏，充分游离暴露门静脉、肝动脉和右外侧叶分支上方的胆管。用无创血管夹阻断肝脏左外侧叶/正中叶的供血，通过观察到缺血肝叶颜改变，确认缺血手术成功。缺血期间，用恒温毯保持小鼠体温。缺血60min后，松开血管夹实施肝叶再灌注，关腹。无缺血颜改变和对再灌注无反应是排除进一步分析的标准。假手术组小鼠不阻断血管，其他操作同缺血再灌注手术组。
25.1.1.3样本取材再灌注3h、6h、12h、24h后将小鼠麻醉处死，收集肝组织和血清样本进行下一步检测分析。小鼠样本取材的具体步骤为：用记号笔在冻存管瓶盖上及瓶身上标明标本信息，准备好取材器械、耗材及取材登记表；麻醉小鼠后，腹部正中大十字切口开腹，用预冷的生理盐水自小鼠左心室灌注，用1 ml注射器自小鼠下腔静脉取血；将缺血肝叶分成5份，1份浸泡于10%中性福尔马林溶液中，另外4份放入冻存管后迅速保存于液氮罐中。
26.1.2构建肝细胞缺血再灌注损伤模型将aml12肝细胞（普诺赛生物科技有限公司，货号cl0602）肝细胞培养24 h后，分成2组（每组3个重复对照）：对照组（control组）和缺氧/复氧组（h/r组）。control组细胞不做任何处理，h/r组细胞缺氧后复氧处理。完成h/r处理后进行项目检测。
27.h/r处理步骤具体为：将肝细胞用高糖、10%血清的dmem培养基在正常培养箱中培养。缺氧处理时把细胞培养基更换为无糖、无血清dmem培养基，并将肝细胞转移至低氧培养箱中(1% o2，5% co2，94% n2)。缺氧6h后，从低氧培养箱中取出肝细胞，将培养基更换为高糖、10%血清的dmem培养基后将肝细胞移至正常培养箱中，构建肝细胞缺氧/复氧（h/r）模型，以模拟小鼠肝脏iri（肝脏缺血再灌注损伤）模型。细胞复氧不同时间段后，收集肝细胞和上清进行下一步实验。
28.1.3结果分析通过蛋白质印迹法（western blot）实验检测步骤1.1.3得到的小鼠肝组织样本和步骤1.2得到的小鼠肝细胞中sirt4蛋白的表达量，结果如图1所示。
29.从图1可以看出，在小鼠及肝细胞缺血再灌注后，肝组织及肝细胞中的sirt4蛋白表达明显低于对照组（sham组和control组）。这些结果提示sirt4可能在肝脏缺血再灌注损伤中发挥重要作用。
30.实施例2：构建sirt4基因敲除和sirt4基因高表达小鼠2.1构建sirt4基因敲除小鼠委托“赛业（苏州）生物科技有限公司”通过crispr/cas9系统构建sirt4基因敲除小鼠（sirt4-ko），构建过程示意图如图2所示。构建步骤具体为：选择sirt4-201作为敲除鼠构建策略的基因位点，首先利用在线crispr设计工具（http://chopchop.cbu.uib.no/）获得4条sgrna序列（分别为sgrna-1：aaggcagcaactctccacagcgg；sgrna-2：ggacacggtgaacccagacaagg；sgrna-3：cggcgacgtgttcctcactgagg；sgrna-4：gctggcggaccggagcactgcgg）；以puc57-sgrna（addgene, 51132）为骨干载体构建sirt4-sgrna表达载体。将纯化的cas9 mrna产物与sgrna混合后，通过femtojet 5247显微注射系统将混合物注射到c57bl/6小鼠单细胞受精卵中，注射后的受精卵移植到母鼠体内。获得f0代小鼠2周后，取小鼠耳组织提取基因组dna鉴定。
31.2.2构建sirt4基因高表达小鼠委托“汉恒生物科技（上海）有限公司”构建过表达sirt4的腺相关病毒（aav-8），通过尾静脉注射构建sirt4基因高表达小鼠（aav-sirt4）。构建步骤具体为：使用携带sirt4目的基因的载体质粒（phbaav-cmv-mcs-3flag-ef1-zsgreen）、paav-rc载体质粒、phelper载体质粒的三质粒包装系统共同转染到293t细胞中，转染72h后收集细胞和培养基，经浓缩、纯化后得到sirt4过表达腺相关病毒；对照病毒使用表达绿荧光蛋白的aav-gfp；病毒用量为每只小鼠2
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转染单位（vg）通过尾静脉注射，每只小鼠注射体积为200μl。
32.2.3结果分析采用蛋白质印迹法（western blot）检测sirt4基因敲除小鼠以及sirt4基因高表达小鼠肝脏中sirt4蛋白的表达量。western blot检测步骤具体为：提取小鼠肝脏组织蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）验证sirt4表达。
33.从图3可以看出，在小鼠肝脏组织中，相比于wt组小鼠，ko（sirt4基因敲除小鼠）组sirt4蛋白几乎不表达。此外，相比于对照组小鼠，sirt4基因高表达小鼠肝脏组织中sirt4蛋白表达含量显著提高。
34.实施例3：sirt4基因敲除和sirt4基因高表达小鼠肝脏缺血再灌注损伤结果分析将步骤2.1得到的sirt4基因敲除小鼠和步骤2.2得到的sirt4基因高表达小鼠分别按步骤1.1.2进行肝脏缺血再灌注（缺血60min，再灌注6h），然后收集再灌注小鼠的肝组织和血清样本，分别进行血清alt、ast含量测定，肝组织石蜡切片he染，炎症反应测定以及免疫荧光染分析。
35.3.1血清alt、ast含量结果分析测定肝脏缺血再灌注损伤后的sirt4基因敲除小鼠以及sirt4基因高表达小鼠血清中的alt、ast含量，结果如图4所示。alt、ast含量测定步骤具体为：1）从-80℃冰箱中取出小鼠血清样本置于冰上融化并混匀；2）按照操作流程，打开全自动生化分析仪（sysmex，chemix 180i），按照全自动生化分析仪样品盘的标记顺序，逐一放入待测的ep管，使用全自动生化分析仪检测alt、ast水平。
36.图4结果表明，sirt4-ko小鼠和aav-sirt4小鼠的iri组（小鼠肝脏缺血再灌注损伤手术组）alt、ast水平均明显高于sham组。而且同iri组相比，sirt4-ko小鼠肝脏缺血再灌注损伤后的alt、ast水平明显高于wt组小鼠的（图4中a所示），而aav-sirt4小鼠肝脏缺血再灌注损伤后的alt、ast水平明显低于aav-gfp组小鼠（图4中b所示）。由于转氨酶（alt/ast）主要分布于肝细胞内，肝细胞受损时，转氨酶释放到血液中，因此，若血液中alt和ast水平升高，则提示肝细胞受损。因此，sirt4基因敲除小鼠的肝脏受损情况更为严重。
37.3.2肝组织石蜡切片he染病理分析将肝脏缺血再灌注损伤后的sirt4基因敲除小鼠以及sirt4基因高表达小鼠肝组织切片、he染后进行病理分析，结果如图5所示。
38.3.2.1实验步骤制备肝组织石蜡标本切片的步骤具体为：1）将装有肝组织的包埋框放入脱水机中，按相应程序操作设置。2）在梯度酒精中脱水：乙醇（30%）1h；乙醇（50%）1h；乙醇（75%）1h；乙醇（85%）1h；乙醇（95%）1h；无水乙醇1h。3）透明：二甲苯和无水乙醇（1∶3）1h；二甲苯和无水乙醇（1∶1）1h；二甲苯和无水乙醇（3∶1）1h；二甲苯1h；二甲苯1h。4）浸蜡：石蜡和二甲苯（1∶1）45 min；石蜡1h。5）开启包埋机，融化石蜡，将已经融化的石蜡倒入包埋模具中，随即将已经浸润石蜡的肝组织切面朝下，放入包埋模具的石蜡中。等石蜡凝固后，将蜡块从模具中取出，用刀片修整蜡块周边。6）将包埋好的蜡块放在冰台上冰冻15min左右。7）将蜡块固定在切片机的卡座内，首先修片，设置切片厚度15-20μm,待暴露切面后设置切片厚度4μm。匀速摇动切片机手轮进行切片。挑选完整切片用毛笔将切片移至冷水中。8）摊片：用镊子分开每张切片，选取最完整、没有皱折的切片，用载玻片将切片转移至恒温（40-45℃）水中。大约10s后切片充分展开，用防脱载玻片将切片捞起，用铅笔标记好信息。9）将切片放入37℃温箱中晾干后室温保存。
39.肝组织石蜡标本切片he染主要步骤具体为：切片60℃烘烤1h
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二甲苯浸泡5min，3次
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100%酒精浸泡1min
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95%酒精浸泡1min
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70%酒精浸泡1min
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双蒸水浸泡1min
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苏木素溶液浸泡5min
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水洗1min
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1%盐酸酒精浸泡1-3s
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水洗1min
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scott液（硫酸镁2g，碳酸氢钠0.35g，蒸馏水100ml）浸泡1min
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水洗1min
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伊红溶液浸泡5min
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双蒸水漂洗
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70%酒精1s
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95%酒精1s
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100%酒精30s，3次
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二甲苯浸泡2min，3次
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封片
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通风橱内晾干，显微镜下拍照。
40.3.2.2结果分析图5结果表明，显微镜下sham组小鼠肝脏组织基本正常，结构整齐；iri组肝组织结构模糊，排列紊乱，其内有大小不等、形状不规则的坏死灶，坏死灶内肝细胞结构模糊，肝细胞核发生典型的坏死性改变，可见核固缩、溶解。而且同iri组相比，sirt4-ko组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织坏死面积和程度明显高于wt组小鼠（图5中a所示），相反地，aav-sirt4组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织坏死面积和程度明显低于aav-gfp组小鼠（图5中b所示）。因此，sirt4基因敲除能够显著加重小鼠肝脏缺血再灌注损伤。
41.3.3炎症反应结果分析采用real-time pcr技术检测肝脏缺血再灌注损伤后的sirt4基因敲除小鼠以及sirt4基因高表达小鼠肝组织细胞中的炎症细胞因子il-1β、il-6、cxcl10、tnfα表达水平，结果如图6所示。由于本实施例所检测的炎症因子il-1β、il-6、cxcl10、tnfα均为翻译蛋白，
且由于从基因转录水平到蛋白翻译水平需要一定的时间，基因水平的变化出现更早，检测基因水平的变化更加灵敏，因此，本实施例采用基因检测技术检测炎症细胞因子表达水平。
42.3.3.1实验步骤3.3.1.1 trizol法提取小鼠肝组织细胞中的总rna1）实验前将镊子、眼科剪、钢珠、ep管、头等耗材高压灭菌备用。2）取出待检测组织样本放置于干冰上；用眼科剪刀剪取绿豆大小肝组织后置于1.5ml的ep管中；每个ep管中放入4颗钢珠，加入1mltrizol裂解液。3）预冷研磨罐，将样本放入研磨罐；设置研磨参数为30hz/s，90s；研磨结束后，观察研磨是否充分，若有未完全研碎组织，重复研磨一次。4）用磁铁取出钢珠；将样本放入离心机，12000rpm转速离心5min，将上清转移至预冷的1.5ml rnase free ep管中。5）酚-氯仿提取：每管加入200μl氯仿，涡旋震荡混匀约15s，室温静置5min；将样本放入4℃离心机，12000g离心15min。6）异丙醇沉淀：离心后样本分为三层，上层为无水相层(主要含rna)，中间层是白层(主要含dna)，下层是粉红层(主要含蛋白质)；小心吸取上层水相至新的rnase free ep 管中（约400μl），加500μl 异丙醇/1ml trizol，轻柔上下颠倒充分混匀，室温静置10min；将样本放入4℃离心机，12000 g离心10min；注意此步吸取上清液时不要贪多，注意不可吸到中间的白物质，否则会导致提取的rna不纯。7）弃去上清，此时ep管底部的白沉淀即为rna。8）洗涤：每管加入1 ml预冷的75%无水乙醇，用移液吹悬白沉淀；将样本放入4℃离心机，7500g离心5min；注意此步中75%乙醇须用depc水配制。9）离心结束后弃去上清，尽量吸干所有残留的乙醇，将er管倒立放入通风橱中放置约5min，尽量将乙醇晾干。10）每管加入60μl depc水溶解ep管中的rna后放置于冰上。11）检测rna：启动nanodrop 2000和相应软件，使用1μl超纯水校准仪器；取1μl rna样本滴加在探头的加样孔，读取rna浓度、a260/a280及a260/a230并记录；其中，rna纯度在1.8左右，浓度在200-2000ng/μl为宜。12）rna电泳检测rna有无降解：配制1%的琼脂糖凝胶，按照1μl rna、1μl marker、8μl depc水配制混合液；将混合液混匀后加入配制好的琼脂糖凝胶，180v恒压电泳15min；电泳结束后拍照保存；完整性较好的rna的18s、28s条带边缘锐利且非常清晰，同时28s条带的亮度在18s条带的两倍或者两倍以上，泳道内没有拖尾。
43.3.3.1.2逆转录1）根据rna浓度计算出2
µ
g rna的对应体积，加入depc水至总体积12μl。加入4μl的4
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gdna wiper mix，混匀离心后将样本放入反转录仪，设置42℃ 2min，结束后取出样本冰上放置。2）每管样本加入4μl的5
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hiscript
ꢀⅲꢀ
qrt supermixa，混匀离心后将样本放入反转录仪，设置程序：50℃ 1h；85℃ 5s；4℃持续。3）结束后取出cdna样本，放入-80℃冰箱保存。
44.3.3.1.3实时荧光定量pcr（real-time pcr）1）cdna模板稀释：将步骤3.3.1.2逆转录得到的cdna用depc水稀释3倍以便得到较好的扩增曲线。2）提前解冻2
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chamq sybr qpcr master mix、cdna模板、引物等，按照如下配方配制pcr体系，其中引物（f）和引物（r）如表1所示。
45.表1 炎症细胞因子基因对应引物（f）和引物（r）的核苷酸序列3）按照每个样本每个指标设置3个复孔配制反应混合液，将dna、2
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chamq sybr qpcr master mix和水加一起混匀。4）用封口膜封板后，将板子3000rpm离心2min，使得pcr体系充分离心到管底。5）将板放入实时定量pcr仪中，设置扩增反应条件为：95℃30s；然后95℃5s，60℃30s，40个循环；最后95℃15s，60℃60s，95℃15s。
46.3.3.2结果分析图6结果表明，sirt4-ko小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中il-1β、il-6、cxcl10、tnfα炎症细胞因子基因表达水平明显高于wt组小鼠（图6中a所示）；相反地，aav-sirt4小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中il-1β、il-6、cxcl10、tnfα炎症细胞因子基因表达水平明显低于aav-gfp组小鼠（图6中b所示）。因此，sirt4基因敲除能够显著加重肝脏缺血再灌注损伤，且与炎症反应有关。
47.3.4免疫荧光染分析采用免疫荧光染技术检测肝脏缺血再灌注损伤后的sirt4基因敲除小鼠以及sirt4基因高表达小鼠肝组织，结果如图7所示。
48.肝组织免疫荧光染：1）烤片：将步骤3.2.1制备的石蜡切片放置于60℃的烤箱中烤片2h。2）脱蜡水合：将切片放置于二甲苯5min
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3次；100%乙醇5min
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2次；95%乙醇5min；70%乙醇5min；超纯水5min
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2次。3）柠檬酸盐高压抗原修复：在高压锅中倒入适量自来水，高压煮沸；取适量柠檬酸盐抗原修复工作液倒入修复盒中，将修复盒放入高压锅中，大火加热至沸腾；将切片放入耐高温的切片架上后放入修复盒，大火煮沸后持续约5min；取出修复盒，放入自来水中冷却后，取出切片。4）超纯水漂洗5min
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2次。5）将切片架放入3%过氧化氢中，室温避光孵育20min。6）1
×
pbs漂洗5min
×
3次。7）封闭：将切片平放于湿盒中，在切片上滴加10%的bsa，将湿盒放置于37℃温箱中30min。8）弃去封闭液，配制适合浓度的一抗
（cd68, gb11067, servicebio, 1:50 dilution; ly6g, gb11229, servicebio, 1:50 dilution），将一抗滴加在切片上，将切片放入湿盒4℃过夜。9）取出湿盒，37℃复温30 min。10）弃去一抗，1
×
pbs漂洗10min
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3次。11）滴加二抗，37℃孵育1h。12）弃去二抗，1
×
pbs漂洗10min
×
3次。13）滴加dapi后封片，4 ℃保存，用荧光显微镜观察结果并拍照。
49.图7结果表明，sirt4-ko小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中cd11b阳性炎症细胞数量明显高于wt组小鼠（图7中a所示）；相反地，aav-sirt4小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中cd11b阳性炎症细胞数量明显少于aav-gfp组小鼠（图7中b所示）。因此，sirt4基因敲除能够显著加重肝脏缺血再灌注损伤，且与炎症反应有关。
50.综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

技术特征：

1. sirt4作为筛选预防、缓解或/和肝缺血疾病药物的药物靶标的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝缺血疾病是由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病。3. sirt4在制备预防、缓解和/或肝缺血疾病药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝缺血疾病是由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病。5.一种预防、缓解和/或肝缺血疾病药物，其特征在于，所述药物中含有sirt4激动剂、sirt4基因或sirt4蛋白。6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述sirt4激动剂包括靶向增强或增加sirt4表达的小分子、抗体或协同性核酸。7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述肝缺血疾病是由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病。8.根据权利要求5-7任一所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

技术总结

本发明属于医药生物技术领域，公开了SIRT4在肝缺血疾病中的应用。该应用特别是在作为药物靶标筛选或制备由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病药物中的应用，所述药物中含有SIRT4激动剂、SIRT4基因或SIRT4蛋白，调节SIRT4的表达从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。本发明首次提出SIRT4基因在制备肝缺血疾病药物中的应用，以SIRT4基因敲除小鼠、肝细胞特异性SIRT4高表达小鼠及与野生型C57小鼠为实验对象，通过肝缺血再灌注损伤模型研究SIRT4基因在肝脏缺血再灌注中的作用，方法真实可靠，为临床上由肝脏缺血再灌注损伤导致的肝缺血疾病提供新的用药途径。致的肝缺血疾病提供新的用药途径。