ag3po
4-uio-66/apt/go/gce
电化学发光传感器及其应用
技术领域
1.本发明涉及电化学检测技术领域，涉及ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器及其应用。
背景技术：
2.电化学发光(ecl)又称为电致化学发光，因其具有灵敏度高、重现性好、选择性好和线性范围宽等优点，近年来引起了广泛的关注，可应用于临床诊断、食品分析等方面。
己烯雌酚(des)是一种环境内分泌干扰物，传统检测des的检测手段通常有：高效液相谱(hplc)，气相谱-串联质谱法，荧光法，电化学荧光以及高效液相谱-质谱(hplc-ms)。然而，这些方法大多需要特殊的仪器，而且工作时间长，前处理繁琐，并且相关成本很高。与这些方法相比，电化学分析法具有灵敏度高、响应速度快、成本低和操作简单等优点，已广泛用于检测、农药、霉菌等，引起了人们的关注。电化学发光法具有灵敏度高、分辨能力高、可以进行多物质检测、仪器价格低廉和检测物用量少等特点，在分析领域得到了广泛应用。
3.共振能量转移是一种新兴的分子光谱方法，特指电子激发能量在能量供体和能量受体对之间的转移。电化学发光-共振能量转移(ecl-ret)结合了两者的优点，是一个具有巨大发展潜力的新领域。它具有小的背景噪声并避免了散射光的影响，其已在生物传感器的构造中得到广泛应用。因此本项研究选择己烯雌酚作为检测物，在玻碳
电极(gce)表面修饰发光体，并通过适配体链接受体形成的共振能量转移，实现对己烯雌酚的灵敏检测。
4.为了增强该传感器的灵敏度，可以对发光体进行修饰。近年来，金属有机骨架(mofs)由于具有较大的比表面积、合适的孔体积、有序的结构和较高的生物相容性，作为修饰电极材料受到越来越多的关注。
技术实现要素：
5.本发明目的之一为，为了进一步提高物质的检测灵敏度，提供一种具有高灵敏度的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器。基于ag3po
4-uio-66与go之间存在的共振能量转移机制，实现了对目标物的定量检测。该传感器具有检测灵敏度高、检测速度快、使用方便的优点。
6.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
7.ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器，电化学发光检测中用作工作电极，包括玻碳电极，玻碳电极外表面依次由作为共振能量供体的ag3po
4-uio-66、与待测物相适应的配体apt以及作为共振能量受体的go修饰，ag3po
4-uio-66和go之间通过apt连接；ag3po
4-uio-66为ag3po4负载的uio-66材料。
8.本发明提供的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器ag3po
4-uio-66与go之间存在的共振能量转移机制，由于ag3po
4-uio-66(供体)的电化学发光发射光谱与go(受体)的紫外可见吸收光谱之间存在较大的重叠面积，所以两者之间存在共振能量转移机制，
ggc gat ggg gta ggg ggt gtg gag ggg ccg gac gga ggg g-3’。
27.作为上述技术方案的优选，其具体步骤如下：
28.b1.含过硫酸钾的磷酸盐缓冲
溶液的配制；
29.b2.配制浓度范围为1.0
×
10-14
mol/l～1.0
×
10-3
mol/l系列不同浓度己烯雌酚标准溶液：
30.具体的，将己烯雌酚用去离子水配制1.0
×
10-3
mol/l溶液后稀释成一系列不同浓度的己烯雌酚标准溶液，浓度范围为1.0
×
10-14
mol/l～1.0
×
10-3
mol/l；
31.b3.标准曲线的绘制：
32.将修饰电极ag3po
4-uio-66/apt/go/gce作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系。将三电极体系置于步骤b2制备的一系列不同浓度己烯雌酚标准溶液中浸泡一定时间，再将三电极体系在含过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液检测发光强度，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录时间-发光强度曲线，建立加入己烯雌酚前后的发光强度差值与己烯雌酚浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
33.b4.检测范围和检测限：
34.以步骤b3测试结果分析，得到在己烯雌酚浓度为1.0
×
10-14
mol/l～1.0
×
10-8
mol/l有良好的线性关系。最低检测限为7.2
×
10-15
mol/l。
35.作为上述技术方案的优选，将ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器修饰电极在4℃的冰箱中放置12h进行孵育后，再制备三电极体系。
36.综上所述，本发明具有以下有益效果：
37.本发明公开了一种电化学发光法检测己烯雌酚的工作电极的制备方法及应用方法，基于ag3po
4-uio-66与go之间存在的共振能量转移机制，实现了对己烯雌酚的定量检测。本发明提供的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce最低检测范围是1
×
10-14
mol/l，检测限为7.2
×
10-15
mol/l。
38.该传感器具有检测灵敏度高、检测速度快、特异性强、线性范围宽、使用方便的优点。
附图说明
39.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
40.图1是该发明中的传感器的制备以及对己烯雌酚的检测的简要流程图和机理图；
41.图2是加入不同浓度己烯雌酚后的发光强度的线性曲线，a～h：0mol/l，1.0
×
10-14
mol/l，1.0
×
10-13
mol/l，1.0
×
10-12
mol/l，1.0
×
10-11
mol/l，1.0
×
10-10
mol/l，1.0
×
10-9
mol/l，1.0
×
10-8
mol/l；
42.图3是加入己烯雌酚前后发光强度的差值和己烯雌酚浓度对数的标准曲线。
43.图4是不同材料修饰电极后的ecl性能曲线图。
44.图5是发光体ag3po
4-uio-66的ecl光谱和受体go的紫外光谱图。
具体实施方式
45.为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以检测己烯雌酚为例，对本发明进行进一步的说明，其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
46.实施例：一种高灵敏度检测己烯雌酚的电化学发光传感器的制备方法及应用方法。
47.一种高灵敏度检测己烯雌酚的电化学发光传感器的制备方法：
48.(1)ag3po
4-uio-66的制备方法：
49.s1.将1.0
×
10-3
mol zrcl4和1.0
×
10-3
mol对苯二甲酸溶于dmf中配成38.7ml的混合液。将溶解的混合物转移到聚四氟乙烯高压釜中。反应在120℃下持续48h。反应结束后将混合物冷却至室温。将高压釜中的液体移出，用dmf和甲醇依次洗涤，在8000rpm下离心15min，120℃真空干燥24h后得到uio-66。
50.s2.将10mg uio-66溶于去离子水中，超声处理1h后，加入2.5ml 0.6m agno3得到混合物a；
51.s3.将步骤s1得到的混合物a室温搅拌充分混匀；
52.s4.将2.5ml 0.2m na2hpo4·
12h2o逐滴加到混合物a溶液中，30℃搅拌混合并超声；在10000rpm下离心15min后，60℃烘干得到所述ag3po
4-uio-66。
53.(2)go的制备方法：
54.a1.将50ml浓硫酸、1g天然鳞片石墨、0.5g硝酸钾和6g高锰酸钾在三口烧瓶混合并搅拌3～5h，得到蓝绿粘稠状混合液；
55.a2.将上述混合液在30℃恒温水浴约1～2h，反应呈泥浆状；
56.a3.在冰水浴中搅拌5min后，加500ml 5％盐酸溶液、300ml 5％过氧化氢溶液，得到棕黄的混合液；
57.a4.吸出上层清液，并水洗至中性，用透析袋透析，得较纯的go溶液。
58.(3)修饰电极ag3po
4-uio-66/apt/go/gce的制备方法：
59.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用微量进样器移ag3po
4-uio-66的乙醇溶液滴于玻碳电极表面，室温干燥，得到ag3po
4-uio-66/gce修饰电极；将apt溶液滴加到用edc
·
nhs活化后的ag3po
4-uio-66/gce表面，在4℃的冰箱中孵育12h得到ag3po
4-uio-66/apt/gce；最后，将go修饰在ag3po
4-uio-66/apt/gce表面，得到ag3po
4-uio-66/apt/go/gce修饰电极，即得到ecl传感器。
60.一种电化学发光法检测己烯雌酚的工作电极的应用方法：
61.b1.含过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液的配制；
62.b2.含不同浓度己烯雌酚标准溶液的配制：
63.将己烯雌酚用无水乙醇配制1.0
×
10-3
mol/l溶液后稀释成一系列不同浓度的己烯雌酚标准溶液，浓度范围为1.0
×
10-14
mol/l～1.0
×
10-3
mol/l；
64.b3.标准曲线的绘制
65.将修饰电极ag3po
4-uio-66/apt/go/gce作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液作为空白溶液检测发光强度。
66.将三电极体系置于一系列己烯雌酚标准溶液(1.0
×
10-14
mol/l，1.0
×
10-13
mol/l，1.0
×
10-12
mol/l，1.0
×
10-11
mol/l，1.0
×
10-10
mol/l，1.0
×
10-9
mol/l，1.0
×
10-8
mol/l)中浸泡2h。再将三电极体系在含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s,进行循环伏安扫描，记录时间-发光强度曲线(t-ecl)，建立加入己烯雌酚前后的发光强度差值与己烯雌酚浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：
△iecl
＝2722.90+479.18log c(nmol/l)，相关系数(r)为0.9948。线性回归方程的检测范围为1.0
×
10-14
～1.0
×
10-8
mol/l，最低检测限为7.2
×
10-15
mol/l。
67.在上述实施例基础上，还进行了对比例1至对比例6的试验，详见表1：
68.表1不同修饰对己烯雌酚的测定结果
[0069][0070][0071]
从表1可以看出：
[0072]
(1)控制制备的搅拌时间对ag3po
4-uio-66几乎没有影响。在相同条件下测试的ag3po
4-cu-mof强度低于本技术所用发光体，并且缩短制备时间对性能有很大影响。
[0073]
(2)对比例1至6采用不同的受体进行测试，au ncs，au nps，au nbs和go均可以对ag3po
4-uio-66的ecl强度产生猝灭，但go可以在己烯雌酚的存在下剥离产生ecl-ret效应，实现对des的检测。au ncs，au nps，au nbs仅可以猝灭，不能产生回升。
[0074]
(3)对比例go对ag3po
4-cu-mof的猝灭效果研究表明，go可以对ag3po
4-cu-mof的ecl强度产生猝灭，但无法回升，并不是简单的同类替换就可以进行检测。
[0075]
对比例7：
[0076]
(1)ag3po
4-uio-66/gce的制备方法：
[0077]
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取5μl 1.0mg/ml ag3po
4-uio-66材料的乙醇溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到ag3po
4-uio-66/gce修饰电极，作为电化学发光测试的工作电极。
[0078]
(2)标准曲线的绘制
[0079]
以ag3po
4-uio-66/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系；并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度。将三电极体系置于一系列己烯雌酚浓度(1.0
×
10-14
mol/l，1.0
×
10-13
mol/l，1.0
×
10-12
mol/l，1.0
×
10-11
mol/l，1.0
×
10-10
mol/l，1.0
×
10-9
mol/l，1.0
×
10-8
mol/l)的标准溶液中浸泡一段时间后，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液中进行循环伏安扫描，记录t-ecl曲线。建立加入己烯雌酚前后的发光强度差值与己烯雌酚浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
[0080]
对比例8：
[0081]
(1)go/apt/gce的制备方法：
[0082]
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取5μl 1.0mg/ml go材料的乙醇溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到go/gce修饰电极，将2.5μl 1.0μm apt修饰在go/gce表面，孵育12h，得到go/apt/gce作为电化学发光测试的工作电极。
[0083]
(2)标准曲线的绘制
[0084]
以go/apt/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系；并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度。将三电极体系置于一系列己烯雌酚浓度(1.0
×
10-14
mol/l，1.0
×
10-13
mol/l，1.0
×
10-12
mol/l，1.0
×
10-11
mol/l，1.0
×
10-10
mol/l，1.0
×
10-9
mol/l，1.0
×
10-8
mol/l)的标准溶液中一段时间后，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液中进行循环伏安扫描，记录t-ecl曲线。建立加入己烯雌酚前后的发光强度差值与己烯雌酚浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
[0085]
对比例9：
[0086]
(1)ag3po
4-uio-66/apt/gce的制备方法：
[0087]
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取5μl 1.0mg/ml ag3po
4-uio-66材料的乙醇溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到ag3po
4-uio-66/gce修饰电极。将2.5μl 1.0μm apt修饰在ag3po
4-uio-66/gce表面，将2.5μl 1.0μm apt修饰在ag3po
4-uio-66/gce表面，孵育12h，得到ag3po
4-uio-66/apt/gce作为电化学发光测试的工作电极。
[0088]
(2)标准曲线的绘制
[0089]
以ag3po
4-uio-66/apt/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系；并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度。将三电极体系置于一系列己烯雌酚浓度(1.0
×
10-14
mol/l，1.0
×
10-13
mol/l，1.0
×
10-12
mol/l，1.0
×
10-11
mol/l，1.0
×
10-10
mol/l，1.0
×
10-9
mol/l，1.0
×
10-8
mol/l)的标准溶液中一段时间后，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液中进行循环伏安扫描，记录t-ecl曲线。建立加入己烯雌酚前后的发光强度差值与己烯雌酚浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
[0090]
表2对已知含量的己烯雌酚的测定结果
[0091][0092][0093]
如表2所示，样品平行检测3次，相对标准偏差小于5％，加标回收率范围为97％～101％。以上结果表明，不用ag3po
4-uio-66/apt/go复合材料修饰而单独用ag3po
4-uio-66或是go修饰的玻碳电极无法检测己烯雌酚，而本发明提供的工作电极及应用方法能够灵敏、快速、准确地检测出己烯雌酚。
[0094]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
技术特征：
1.ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器，电化学发光检测中用作工作电极，其特征在于：包括玻碳电极，玻碳电极外表面依次由作为共振能量供体的ag3po
4-uio-66、与待测物相适应的配体apt以及作为共振能量受体的go修饰，ag3po
4-uio-66和go之间通过apt连接；ag3po
4-uio-66为ag3po4负载的uio-66材料。2.根据权利要求1所述的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器，其特征在于，ag3po
4-uio-66与go的质量比为2:1。3.根据权利要求1所述的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器，其特征在于，ag3po
4-uio-66/apt/go/gce的制备方法包括如下步骤：将玻碳电极抛光，依次用硝酸、无水乙醇和去离子水分别超声，自然晾干待用；用微量进样器移取ag3po
4-uio-66的乙醇溶液滴于玻碳电极表面，室温干燥，得到ag3po
4-uio-66/gce修饰电极；将apt和go滴在经edc
·
nhs活化后的ag3po
4-uio-66/gce电极表面，得到所述ag3po
4-uio-66/apt/go/gce。4.根据权利要求1所述的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器，其特征在于，所述ag3po
4-uio-66的制备方法包括如下操作步骤：s1.将uio-66通过超声充分分散于去离子水中，再加入agno3充分溶解混合，得到混合物a；s2.将na2hpo4溶液滴加到混合物a中，搅拌混合并超声；离心洗涤干燥，得到所述ag3po
4-uio-66。5.根据权利要求3所述的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器，其特征在于，所述ag3po
4-uio-66的滴涂量为5.0μl，浓度为1.0mg/ml；所述go的滴涂量为2.5μl，浓度为1.0mg/ml。6.根据权利要求1至5中任一项所述的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器的应用，其特征在于：用于水体中环境内分泌干扰物的检测。7.根据权利要求6所述的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器的应用，其特征在于，环境内分泌干扰物为己烯雌酚，检测方法包括：ag3po
4-uio-66/apt/go/gce作为电化学发光测试的工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系进行电化学发光检测己烯雌酚，apt为5
’‑
nh
2-ggc gat ggg gta ggg ggt gtg gag ggg ccg gac gga ggg g-3’。8.根据权利要求7所述的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器的应用，其特征在于，还包括如下步骤：b1.含过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液的配制；b2.配制浓度范围为1.0
×
10-14
mol/l～1.0
×
10-3
mol/l系列不同浓度己烯雌酚标准溶液；b3.标准曲线的绘制：将修饰电极ag3po
4-uio-66/apt/go/gce作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于步骤b2制备的一系列不同浓度己烯雌酚标准溶液中浸泡一定时间，并以含过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液作为空白溶液检测发光强度，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录时间-发光强度曲线，建立加入己烯雌酚前后的发光强度差值与己烯雌酚浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
9.根据权利要求6所述的ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器的应用，其特征在于，将所述ag3po
4-uio-66/apt/go/gce电化学发光传感器在4℃的冰箱中放置12h后再制备所述三电极体系。
技术总结
本发明涉及电化学检测技术领域，涉及Ag3PO
技术研发人员：
单学凌 宋清远 董春萍 卜李银 陈智栋 椎木弘
受保护的技术使用者：
常州大学
技术研发日：
2022.09.06
技术公布日：
2022/12/16
