有害微生物的控制
本节主要掌握一些名词的定义和几种有害微生物控制方法。
一、几个基本概念
控制有害微生物主要有以下几种措施：
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象
(二)消毒(disinfection)
从字义上来看，消毒就是消除毒害，这里的“毒害”就是指传染源或致病菌的意思，英文中的“dis-infection”也是“消除传染”的意思。所以，消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。例如一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法，等等。 (三)防腐(antisepsis)
防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。
防腐的措施很多，主要有：
(1)低温利用4℃以下的各种低温(O℃、-20℃、-70℃、-196℃等)，以保藏食物、药品和菌种等。
(2)缺氧近年来，已采用在密闭容器中加入除氧剂来有效地防止食品和粮食等的霉腐、变质，并达到保鲜的目的。除氧剂的种类很多，主要原料是铁粉，再加上一定量的辅料和填充剂制成，它对新鲜食品具有良好的保鲜功能。
(3)干燥采用晒干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏是最常见的防止霉腐的方法。此外，在密封条件下，用石灰、无水氯化钙、五氧化二磷、浓硫酸、氢氧化钾或硅胶等作吸湿剂，也可很好地达到食品、药品和器材等长期防霉腐的目的。
(4)高渗通过盐腌和糖渍等高渗措施来保存各种食物，是在民间流传已久的防腐方法。
(5)高酸度用高酸度也可达到防腐的目的。泡菜就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜蔬菜产生大量乳酸，借以达到抑制杂菌和长期保藏的目的。
(6)防腐剂在有些食品、调味品、饮料或器材中，可以加入适量的防腐剂以达到防霉腐的目的。例如，酱油中常以苯甲酸来防腐；墨汁中可加入尼泊金作防腐剂；化妆品可加入山梨酸、脱氢醋酸等来防腐；食品和饲料可加入二甲基延胡索酸(DMF)来防腐等。
(四)化疗(chemotherapy)
化疗即化学。它是利用具有高度选择毒力(selectivetoxicity，即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性)的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学剂(chemotherapeutant)。最重要的化学剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。
2．湿热灭菌法(moistheatsterilization)湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10分钟后即可杀死，酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死，而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15分钟才能杀死。
(1)常压法
巴氏消毒法(pasteurization)用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌(如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌)，而又不影响它们的风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60～85℃下处理15秒至30分钟。具体的方法可分两类，第一类是较老式的，称为低温维持法(LTH，lowtemperatureholdingmethod)，例如在63℃下保持30分钟可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，称为高温瞬时法(HTST，hightemperatureshorttime)，用于牛奶消毒时只要在72℃下保持15秒钟即可。据报道，不管用LTH或HTST法，都不能杀灭引起Q热的病原体——Coxiellaburnetii(伯氏考克斯氏体，是一种立克次氏体)。
煮沸消毒法一般用于饮用水的消毒(100℃下数分钟)。
间歇灭菌法(fractionalsterilization或tyndallization)又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮15～60分钟，以杀死其中所有微生物的营 养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌的含硫培养基就应该用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元素硫经常规的加压灭菌(121℃)后会发生熔化，而在99～100℃的温度下则呈结晶形。
(2)加压法
常规加压灭菌法(normalautoclaving)这是一种应用最为广泛的灭菌方法。其原理十分简单：将待灭菌的物件放置在盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅(或家用压力锅)内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸气压逐渐上升，从而温度也上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃(压力为1kg／cm2或15磅／英寸2)，时间维持15～20分钟，也可采用在较低的温度(115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2)下维持35分钟的方法。此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。
封装外壳连续加压灭菌法(continuousautoclaving)在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。主要操作是将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135～140℃下处理5～15秒钟。这种灭菌方法有很多优点：①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，例如，在抗
生素发酵中，它比以往的“实罐灭菌”(120℃，30分钟)提高产量5～10％；②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；④适宜于自动化操作；⑤降低了操作人员的劳动强度。有关灭菌温度和时间对营养成分破坏的影响可见表7－12。
(二)影响加压蒸汽灭菌效果的因素
(1)灭菌物体含菌量的影响不同的微生物个体(包括营养体和孢子)的耐热性是有差别的，所以，灭菌物体中的含菌量越高，杀死最后一个个体所需的时间就越长。在实践上，由天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。所以灭菌的温度和时间也应有差别。
(2)灭菌锅内空气排除程度的影响加压蒸汽灭菌法的原理是在驱尽锅内空气的前提下，通过加热把密闭锅内纯水蒸汽的压力升高而使蒸汽温度相应提高，也就是说是依靠温度而不是压力来达到灭菌的目的。因此，在一切利用加压蒸汽灭菌法的场合下，必须做到彻底排除灭菌锅内的残余空气。
要检验灭菌锅内空气排除度，可采用多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时装有压力表和温度计，其次是将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听到“扑扑”声而未见有气泡冒出，也可证明锅内已是纯蒸汽了。
(3)灭菌对象pH的影响灭菌对象的pH对灭菌效果有较大的影响(表7-15)。pH6.0～8.0时，微生物较不易死亡；pH＜6.0时，最易引起死亡。
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(4)灭菌对象的体积灭菌对象体积的大小会影响热的传导速率。盛放培养液的玻璃器皿，其体积大小对灭菌效果的影响甚为明显。因此，在实验室工作中，要防止用常规的压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培养基的灭菌。
(5)加热与散热速度在加压灭菌时，一般只注意达到所需压力后的维持时间。事实上，在达到该压力前(即“上磅前”)的预热速度有快有慢，还有在达到灭菌要求后，散热的速度(即“下磅”速度)也有快有慢，这两段时间也对灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌操作中对这些技术细节都应加以注意。
(三)高温对培养基成分的有害影响及其防止
在加压蒸汽灭菌时，高温尤其是长时间的高温除对培养基中的淀粉成分有促进糊化和水解等少数有利影响外，只会对培养基成分产生很多不利的影响。
高温对培养基的不利影响：
▲产生混浊或形成不溶性沉淀
▲破坏营养（ PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；
▲泽加深（褐变如产生氨基糖等）；
▲改变培养基的pH值（通常下降0.2）；
▲形成有害物质，抑制微生物生长；
消除有害影响的措施很多，主要有：
(1)采用特殊加热灭菌法例如，对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；对含Ca2 或Fe3 的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；对含有在高温下易破坏成分的培养基(如含糖组合培养基)可进行低压灭菌(在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟)或间歇灭菌；在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌；等等。
(2)过滤除菌法对培养液中某些不耐热的成分可采用过滤除菌法“灭菌”，例如滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器(Seitz滤器)、素烧瓷过滤器(Chamberland滤烛)以及硅藻土过滤器(Berkefeld滤烛)等。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。
(3)其他方法在配制培养基时，为避免发生沉淀，一般应按配方逐一加入各种成分。另外，加入0.01％EDTA(乙二胺四乙酸)或0.01％NTA(氮川三乙酸)等螯合剂
氢键受体到培养基中，可防止金属离子发生沉淀。最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯等对个别成分进行灭菌处理。
三、化学杀菌剂或制菌剂
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抑制或杀灭微生物的化学因素种类极多、用途广泛、性质各异。主要有以下数类：(一)表面消毒剂
常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。
表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内的化学用的化学药剂。它们的种类很多。为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采用在临床上最早使用的消毒剂——石炭酸作为比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最=高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi(伤寒沙门氏菌)。由于各种消毒剂的杀菌机制各不相同，故石炭酸系数仅有一定的参考价值。
(二)抗代谢药物的代表——磺胺类药物
磺胺是在青霉素应用前许多细菌性传染病的最有效化学剂。1940年，Wood和Fildes研究了磺胺的作用机制，并阐明因为它的结构与细菌的生长因子——对氨基苯甲酸(PABA，para-aminobenzoicacid)高度相似(图7-19)，因而两者发生了竞争性拮抗作用。最后，美国的Lederle实验室的学者发现PABA是叶酸的一个组分。
效应评价指标：
最低抑制浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）
半致死剂量（50％ lethal dose, LD50）
最低致死剂量（Minimum lethal dose, MLD）
石碳酸系数（phenol coefficient）
(三)抗生素
概念：
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抗生素：微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量代谢产物，在很低浓度下就能抑制或杀死其它微生物的生长。
抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱～：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）；窄谱～：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素）
作用机理：
抑制细胞壁的合成；（如：青霉素）
破坏细胞膜功能；（如：多粘菌素可作用于膜磷脂使膜溶解）
抑制蛋白质合成；（如：氯霉素，四环素、链霉素等）
液体速凝剂干扰核酸代谢；（如：利福霉素、新生霉素、丝裂霉素、灰黄霉素）
